玉米多肽制备技术及其抗氧化和抗炎活性的研究

来源 :江苏大学 | 被引量 : 15次 | 上传用户:scsnlaosi
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玉米是世界三大粮食作物之一,主要用于加工成淀粉,其主要副产物玉米蛋白,其氨基酸组成不平衡,且含大量疏水性氨基酸,不溶于水。利用玉米蛋白酶解制备生物活性肽存着蛋白水解度低、蛋白转化率低以及活性差等问题。目前,对玉米多肽活性的研究主要还集中在抗氧化活性和降血压活性的研究,对多肽的其他功能性活性的探索十分有限。因此,本研究利用超声波预处理玉米蛋白,辅助制备玉米抗氧化肽,旨在提高其水解度、蛋白转化率以及抗氧化活性;利用体外模拟胃肠道消化追踪抗氧化活性的稳定性以及理化性质的变化;于此同时,探索玉米多肽对结肠炎、血管内皮细胞炎症的抗炎活性以及对内皮细胞抗炎的信号通路。主要研究内容及结果如下:(1)研究了超声辅助玉米蛋白酶解制备玉米抗氧化肽以及超声对其理化性质以及抗氧化活性的影响。通过正交设计L9(34)实验,以抗氧化活性(DPPH IC50)、蛋白转化率、水解度为综合评价指标优化出了最优超声处理玉米蛋白的条件:超声功率为65 W/L,超声时间间歇比为2s/2s,超声处理温度为50℃,超声时间为25 min;在最优超声处理条件下,玉米蛋白的水解度为24.70%、蛋白转化率为62.85%,与无超声预处理的传统方法比较分别提高了28.17%和29.93%;玉米蛋白水解产物中200-1000 Da和1000-3000 Da分子量段玉米多肽含量达到63.31%和17.69%,相对于传统酶解的百分比分别增加了11.84%和21.29%;<200 Da和>3000 Da分子量段多肽含量为8.13%和7.90%,相对于传统酶解的百分比分别下降了15.61%和46.5%;玉米蛋白水解产物中游离氨基酸含量为55.24μg/m L,减少了5.93μg/m L;多肽含量为777.18μg/m L,增加了85.66μg/m L;以多肽形式存在的疏水性氨基酸含量为391.95μg/m L,增加了55.17μg/mL;玉米蛋白水解产物的抗氧化活性大幅度增加,其DPPH自由基清除率的IC50由2.41 mg/m L降低到了1.95 mg/mL,·OH清除活性的IC50由9.98 mg/mL降低到了7.61 mg/m L。(2)将按照第二章优化条件制备的玉米抗氧化肽进行体外模拟胃肠道消化,研究玉米抗氧化肽的抗氧化活性的稳定性及其理化性质的变化,对模拟胃肠道消化后的玉米多肽进行分离纯化、筛选表征出高抗氧化活性的玉米肽。模拟消化后:玉米蛋白的水解度从22.67%提高到39.40%,多肽含量由97.67%下降到77.51%;玉米抗氧化肽中以自由氨基酸形式存在的Pro、Asp和Glu含量几乎没变,自由氨基酸Arg、Tyr和Met的含量显著增加;DPPH自由基清除率从33.51%升高到46.29%,·OH自由基清除率没有显著性变化,还原力下降,其吸光值从0.54升高到0.80,亚油酸自氧化抑制率从84.72%下降到41.53%;从消化产物中分离纯化出两个组分,其DPPH自由基清除率的IC 50值分别为10.251μg/m L和20.271μg/mL,经结构鉴定该两个组分分别为Tyr-Pro-Gln(406.45 Da)、Ala-Tyr-Leu(365.43 Da)。(3)利用细胞模型和动物模型研究了玉米抗氧化肽对结肠炎的抗炎活性。玉米抗氧化肽消化产物可以显著(p<0.05)降低TNF-α诱导的Caco-2细胞引起的COX-2、INOS和IL-8的表达;玉米抗氧化肽对于DSS所诱导的结肠炎小鼠的体重减轻以及炎症临床症状具有明显的改善效果;玉米抗氧化肽可以显著性(p<0.05)降低DSS所诱导的结肠炎小鼠的结肠组织中的MPO活性、TNF-α和IL-6的含量;玉米抗氧化肽可以明显改善DSS所诱导的结肠炎小鼠的结肠组织的形态学特征,减轻结肠组织损伤,减轻炎性细胞的浸润。(4)利用血管内皮EA.hy926细胞模型、体外模拟胃肠道消化结合小肠上皮Caco-2细胞模型,研究玉米醇溶蛋白多肽对血管内皮细胞的抗炎活性影响以及其在Caco-2单层细胞的吸收率。碱性蛋白、嗜热蛋白酶和中性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白制备得到水解产物可以显著降低TNF-α诱导血管内皮细胞EA.hy926粘附因子VCAM-1表达(p<0.01),该玉米多肽对血管内细胞炎症具有良好的抗炎活性;模拟胃肠道消化对玉米醇溶蛋白酶解产物的抗炎活性没有显著性影响;嗜热蛋白酶酶解物消化产物经Caco-2单层细胞模拟小肠上皮吸收4 h后,其抗炎活性大幅度增加,可以显著降低VCAM-1和ICAM-1表达(p<0.01);嗜热蛋白酶酶解物消化产物经Caco-2单层细胞模拟小肠上皮4 h的转运,其多肽转运率为1.2%;嗜热蛋白酶酶解产物经模拟胃肠道消化和Caco-2单层细胞吸收后,鉴定出11种新颖的抗炎肽,其中3种多肽,PPYLSP,IIGGAL和FLPPVTSMG在低浓度(0.2 mM)下,表现出良好的抗炎活性。(5)研究了玉米抗炎肽对血管内皮细胞炎症相关的NF-κB信号通路作用。玉米醇溶蛋白水解物和三种多肽(PPYLSP,IIGGAL和FLPPVTSMG)均能显著(p<0.01)降低TNF-α诱导EA.hy926细胞粘附因子的表达,在浓度分别为4mg/mL,0.4 mM时,其对ICAM-1和VCAM-1的降低量分别为22.63%-62.73%和56.23%-76.62%;均能显著性(p<0.05)降低TNF-α诱导EA.hy926产生的活性氧自由基,其抑制率能达到25.27%-36.18%;均能显著性(p<0.01)降低TNF-α诱导EA.hy926细胞对单核细胞的粘附性,其抑制率为24.16%-60.15%,其中多肽FLPPVTSMG效果显著性好于多肽IIGGAL;均能显著性(p<0.05)阻止TNF-α引起EA.hy926的TNFR1的表达下调;均能显著性减轻TNF-α诱导EA.hy926的p65磷酸化(p<0.01)。玉米醇溶蛋白水解物和三种多肽对TNF-α引起的TNFR2的表达没有影响;对TNF-α诱导EA.hy926细胞的IκBα和IκBβ降解没有显著性影响;以上结果表明超声波辅助玉米蛋白酶解制备玉米抗氧化肽可以有效提高玉米蛋白的蛋白转化率、水解度以及抗氧化活性;玉米抗氧化多肽的抗氧化活性在肠道消化过程中具有良好的稳定性;玉米抗氧化肽对结肠炎具有良好的抗炎活性;玉米醇溶蛋白水解肽对血管内皮细胞炎症具有良好的抗炎活性。该研究为玉米蛋白制备抗氧化肽以及研发抗炎肽功能性产品提供了新颖思路和理论基础。
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