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研究背景:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,随着生活水平的提高,近年来发病率也呈上升趋势。在某些地区,乳腺癌跃居女性恶性肿瘤死亡的首位。研究表明,乳腺癌的发生发展是多基因多因素共同作用的结果,且有家族遗传倾向。在乳腺癌高发家族中,存在一个或多个常染色体显性乳腺癌易感基因,其中最常见的是乳腺癌易感基因BRCA1(Breast cancer susceptibility gene 1)和BRCA2(Breastcancer susceptibility gene 2)。相关研究表明,BRCA1不仅能够抑制细胞生长,还参与细胞周期和基因转录的调控、DNA损伤修复以及细胞凋亡等多种重要细胞活动,在维持基因组稳定性中起重要作用。全球范围有遗传性乳腺癌和卵巢癌家族史的人群中BRCA1突变率为12.80%,但是分析130名中国女性乳腺癌BRCA1突变率为3.8%。80%以上的遗传性乳腺癌和部分散发乳腺癌的发病与BRCA1基因结构及功能异常有密切关系。大约有40-50%的遗传性乳腺癌是由BRCA1突变引起的。探讨BRCA1的作用机制,为乳腺癌的早期诊断、临床治疗提供新的靶点。目的:构建人BRCA1基因真核表达载体,筛选出高表达BRCA1基因的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为观察高表达BRCA1蛋白的乳腺癌细胞株的生物学特性及细胞周期变化奠定基础。方法:从胎盘中提取总RNA,RT-PCR方法扩增cDNA序列,扩增后产物与pMD18-T载体连接,并转化大肠杆菌JM109,挑克隆,提取质粒,XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,选择正确的克隆质粒,用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后,胶回收酶切片段;真核表达载体pcDNA3.1(+),经双酶切后,胶回收线性载体片段,上述两者共同的胶回收片段与T4DNA连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-BRCA1,并转化大肠杆菌JM109,用无内毒素质粒提取试剂盒重组质粒pcDNA3.1-BRCA1,转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231。以G418筛选从而获得稳定的、高表达BRCA1的细胞株MDA-MB-231。提取转染前后细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达。结果:从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基。测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片断大小和DNA序列均正确的BRCA1基因N端933个碱基序列。转染后较转染前的乳腺癌细胞株中BRCA1表达水平增高。应用SPSS统计软件进行统计学处理(P＜0.01)。结论:1.成功克隆人乳腺癌BRCA1基因。2.克隆载体中插入BRCA1的序列正确3.成功构建了pcDNA3.1-BRCA1真核表达载体。4.BRCA1基因在乳腺癌细胞株中成功高表达。