NLRP3炎症小体是NLRP3分子、凋亡相关斑点样蛋白(ACS)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)组成的一种蛋白复合体,其激活能够促进下游细胞因子(白细胞介素-1β、白细胞介素-18)的成熟和释放,进而诱导机体炎症反应的发生发展。近年来许多研究表明,NLRP3炎症小体的激活与各种呼吸道疾病息息相关。本研究中,通过建立体内外模型探讨NLRP3炎症小体在纳米级炭黑颗粒(carbon black nanoparticles,CBNPs)暴露致炎症反应中的重要调控作用及其激活的分子机制。结果发现CBNPs通过激活NLRP3炎症小体,促进了肺部炎症及其他肺外器官的炎症反应。抑制NLRP3炎症小体的异常激活可在一定程度上缓解由CBNPs诱导的肺部急性炎症,进一步的说明了抑制NLRP3炎症小体的异常激活有潜在可能抑制肺损伤的发生发展,为进一步研究CBNPs诱导的呼吸系统疾病发生发展的分子机制提供新线索。一、CBNPs的体内外毒性研究1.探讨CBNPs暴露对RAW264.7细胞的毒性作用,配制浓度为50、100、200μg/ml的CBNPs悬浊液,采用CCK-8活性测定法分别观察CBNPs暴露6 h、12 h、24 h后,细胞活性的改变,结果显示,CBNPs暴露后细胞增殖活性显著降低,且下降趋势呈CBNPs浓度梯度依赖性,差异有统计学意义。2.探讨CBNPs暴露对小鼠的影响,建立C57BL/6小鼠的动态吸入CBNPs的模型,小鼠外周血进行血常规检查,发现CBNPs暴露3天组小鼠外周血单核巨噬细胞百分比显著增加,CBNPs暴露7天组小鼠外周血中性粒细胞百分比显著增加、CBNPs暴露3天组、暴露7天组外周血嗜酸性粒细胞百分比均显著增加,差异有统计学意义。3.选取CBNPs暴露实验的小鼠肺组织进行病理学检查,结果显示,CBNPs暴露3天组的小鼠肺组织开始出现炎症反应,主要表现为炎性渗出炎细胞浸润,随着染毒时间增加炎症程度逐渐增加,CBNPs暴露14天组小鼠肺组织出现肺气肿、肺纤维化等病理改变。4.选取CBNPs暴露实验的小鼠肝组织、肠组织进行病理学检查,结果显示,CBNPs暴露组小鼠肝细胞肿大,细胞质疏松化呈网状,肝血窦受压变窄,出现点状坏死灶并伴随炎性细胞浸润。CBNPs暴露组小鼠出现肠道应激反应,可见明显的炎性浸润。5.选取CBNPs暴露实验的小鼠肺组织进行Masson染色,结果显示,CBNPs暴露组小鼠肺泡结构破坏,肺泡塌陷融合,肺间质及支气管周围的胶原纤维分布增多。6.收集CBNPs暴露3天组小鼠肺泡灌洗液及血清进行ELISA实验,结果显示CBNPs暴露3天组小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-1β水平增加,血清中IL-1β及IL-6水平增加,差异具有统计学意义。二、CBNPs激活NLRP3炎症小体的相关机制研究1.由于IL-1β含量在CBNPs暴露组小鼠的血清及肺泡灌洗液中显著增加,且病理学及血常规结果均揭示小鼠出现炎症反应,因此,采用免疫组织化学染色的方法检测小鼠肺组织及其他肺外器官NLRP3表达的变化。结果显示,与对照组相比,CBNPs暴露组小鼠肺组织NLRP3、IL-1β表达均上调。2.原代培养骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)并进行CBNPs体外染毒实验,实验结果显示,BMDMs经CBNPs暴露6 h和12 h后,细胞上清中的IL-1β水平均显著增加,并呈现一定的浓度依赖性,差异具有统计学意义。3.BMDMs经CBNPs暴露12 h后,利用q RT-PCR和Western Blot检测NLRP3相关基因分子水平的变化。结果显示,CBNPs暴露后NLRP3、caspase-1和IL-1β的m RNA及蛋白水平均显著升高,差异具有统计学意义。4.ROS产生、Cathespin B的释放被认为是NLRP3炎症小体的激活信号,因此本研究采用流式细胞仪检测BMDMs细胞染毒后胞内ROS的水平,通过加入Cathespin B抑制剂研究NLRP3炎症小体的激活。结果显示,CBNPs暴露后ROS的产生显著增加,且程浓度依赖性,Cathespin B抑制剂加入后,CBNPs暴露后NLRP3炎症小体相关基因蛋白水平表达被抑制,差异具有统计学意义。三、NLRP3基因敲除对纳米级炭黑颗粒诱导肺损伤的影响为进一步验证NLRP3炎症小体在CBNPs暴露诱导的肺损伤的作用,本研究构建了NLRP3基因敲除小鼠CBNPs动态染毒模型。1.通过免疫组织化学染色的方法,验证所构建转基因小鼠的NLRP3表达水平,结果显示,NLRP3基因敲除小鼠在对照组和暴露组中NLRP3蛋白表达均未见明显变化;但在WT小鼠中,CBNPs暴露组小鼠肺组织中NLRP3表达水平显著增加。2.ELISA结果显示,NLRP3基因敲除小鼠肺泡灌洗液及血清中IL-1β含量在CBNPs暴露后无显著差异;但CBNPs暴露显著增加了WT小鼠肺泡灌洗液及血清中IL-1β的水平。3.病理学结果显示,CBNPs暴露3天后,NLRP3基因敲除小鼠肺组织未观察到明显急性炎症反应;但WT小鼠肺组织观察到明显的炎性细胞渗出,表现出肺部急性炎症反应。综上所述,本研究通过建立了C57BL/6小鼠CBNPs动态吸入的模型,观察到CBNPs暴露后小鼠肺损伤及其他肺外器官的损伤,肺组织中NLRP3炎症小体被激活。表明短期暴露可以诱导机体肺组织发生急性炎症,炎症的迁延不愈导致了肺组织器质性病理改变。体外实验结果显示,CBNPs暴露可以诱导NLRP3炎症小体的激活,并且是通过ROS产生及Cathespin B释放这两个激活信号共同发挥作用的。抑制NLRP3炎症小体的激活,可以抑制由CBNPs暴露引起的肺组织炎症的进程,从而一定程度上降低肺纤维化发生发展的可能。因此本研究认为,NLRP3可以作为CBNPs暴露预防和治疗的靶点,为CBNPs暴露后呼吸系统损伤修复及干预措施提供了新的视角。