G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptor，GPCRs)是细胞表面最大的受体超家族，参与机体广泛的生理和病理过程，目前是新药发现和研究的重要热点领域之一。资料表明，大约50％市售药物的作用靶点为GPCRs。对GPCRs信号转导的研究主要聚焦于负调节子β-arrestins，后者又称β-抑制蛋白，包括β-arrestin1和β-arrestin2。β-arrestins主要参与GPCRs的脱敏、内化、胞内循环以及G蛋白非依赖信号转导的激活。相应配体激活受体所引起的G蛋白信号和(或)β-arrestin信号的差异，最终决定了GPCRs的细胞生物学效应。GPCRs与β-arrestin的相互作用决定了受体的功能选择性、药物疗效以及不良反应。依据GPCRs与β-arrestin的相互作用将GPCRs分成A和B两型，A型受体与β-arrestins形成不稳定的复合物，以与β-arrestin2结合为主，二者在细胞膜或近细胞膜处分离后，受体快速返回到细胞膜；B型受体则能与β-arrestin1、β-arrestin2同等力量结合成稳定的复合物，慢速循环到细胞膜。　　 Apelin受体(putativereceptorproteinrelatedtoAT1，APJ)是GPCRs超家族的成员，在中枢神经系统和心血管系统中参与多种生理功能的调控过程，成为治疗原发性高血压、缺血性心脏病、心力衰竭的最具前景的药物靶点之一。APJ属A型还是B型受体?β-arrestins在Apelin/APJ系统的信号转导中的作用和作用途径至今尚未见相关报道。　　 近几年随着技术的发展，出现了一种能够在活细胞中实时动态监测蛋白质-蛋白质之间相互作用的新技术，即生物发光共振能量转移(biolumininescenceresonanceenergytransfer，BRET)。利用该技术能长时间实时动态检测GPCRs与β-arrestins的相互作用，结合激光共聚焦、免疫共沉淀等技术，可以揭示β-arrestins在GPCRs的脱敏、内化、复敏以及G蛋白非依赖的途径中的作用及作用机制。　　 本研究的目的是利用生物发光共振能量、共聚焦免疫共定位和免疫共沉淀技术，研究apelin-13激活的APJ与β-arrestins之间的相互作用，利用基因突变的方法研究APJ的羧基末端结构与信号转导的关系，为揭示相关疾病发生的分子机理、探寻相关疾病治疗的新突破点及新药开发提供依据。　　 本实验构建了多种APJ、突变的APJ以及β-arrestin的各种表达载体，经过基因测序、westernblot检测以及激光共聚焦证实受体载体构建成功。然后瞬间或稳定转染人胚胎肾(humanembryonickidkey，HEK293)细胞，建立单独或与β-arrestin1或β-arrestin2共表达APJ的细胞株系的蛋白过表达系统。应用生物发光共振能量转移方法结合免疫共定位、免疫共沉淀技术，在活细胞内实时动态观察apelin-13刺激的APJ与β-arrestins之间的相互作用。　　 HA-APJ和eGFP-β-arrestin1或eGFP-β-arrestin2单独或共同转染HEK293细胞，apelin-13处理不同的时间后收集细胞，进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜结果显示：在5分钟内，受体与β-arrestin共定位于细胞膜上，随着时间的迁移，二者向胞内移动，15分钟达高峰，30分钟在近膜区已分离。　　 稳转的HA-APJ-HEK293细胞瞬间转染flag-β-arrestin1或flag-β-arrestin2质粒后，提取蛋白进行免疫共沉淀实验，用抗HA抗体进行免疫沉淀，结果显示：在共转染HA-APJ和flag-β-arrestin1细胞中得到100KDa的条带；在共转染HA-APJ和flag-β-arrestin2细胞中得到95KD的条带；用抗-flag抗体进行免疫沉淀也得到相似的结果并提示：信息转导过程中APJ主要与β-arrestin2可逆结合。　　 本实验采用构建的两组真核重组质粒：peGFP-APJ-pcDNA3.1和Rluc-β-arrestin1、peGFP-APJ-pcDNA3.1和Rluc-β-arrestin2，瞬间转染HEK293细胞，转染后48h，采用BRET1和eBRET两种方法在活细胞内实时、动态的研究了两者之间的相互作用。结果显示：APJ与β-arrestin1的结合比β-arrestin2的结合时间早，BRET值低，且二者在结合后迅速的解离，BRET值也随之下降，APJ与β-arrestin1的BRET值在20分钟达高峰后迅速下降，APJ与β-arrestin2的BRET值在25分钟达最大并迅速的下降。利用Graphpadprism5.0分析软件的非线性回归计算出最大半量EC50值分别为(3.8±1.2)×10-8M，(5.0±1.2)×10-8M，两者差异不显著。　　 免疫共定位、免疫共沉淀及BRET实验都证实apelin受体和β-arrestins的相互作用符合典型的A型受体的特点。　　 研究证实，GPCRs的羧基末端是与β-arrestin结合的主要部位，丝/苏氨酸残基是主要的磷酸化位点。为了研究APJ的羧基末端的磷酸化位点与细胞信号转导的关系以及与β-arrestin精确的结合部位，我们检测了表达末端缺失突变体的细胞内关键信号分子：细胞外信号调节激酶(extracelluLar-regulatedkinases1/2，ERK1/2)、环磷酸腺苷酶(cycleAMPcAMP)、血清反应元件(Serumresponseelement，SRE)和cAMP反应元件(cAMPresponseelement，CRE)。　　 弗司柯林(forskolin，FSK)激活转染APJ和突变体C320Z、A332Z、A344Z、Q352Z的HEK293细胞会有cAMP的产生，采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedimmunoassay，ELISA)检测发现，apelin-13对这一过程有抑制作用，结果显示：除Q352Z外，突变体C320Z、A332Z、A344Z、Q352Z对FSK诱导的cAMP水平的抑制作用均显著降低。　　 采用Westernblot分别检测了时间和浓度依赖的ERK1/2磷酸化。结果显示：1)在时间依赖的ERK1/2的磷酸化中，受体的磷酸化在15分钟达到高峰，60分钟恢复到基础水平。与apelin-13激活的野生型APJ-HEK293细胞相比，突变体C320Z、A332Z、A344Z、Q352Z不同程度的降低了ERK1/2的磷酸化。其中以C320Z、A332Z最为显著；2)在浓度依赖的ERK1/2的磷酸化中，在apelin-13处理的分别表达APJ和APJ的突变体的HEK293细胞中，从10-9～10-7M，ERK1/2的磷酸化值随浓度的增加而升高，但突变体A332Z、A344Z、Q352Z的升高值相对于野生型APJ升高的值降低且差异显著。　　 本研究表明，apelin激活ERK1/2是通过PKC通路，而cAMP依赖的蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)通路依赖于cAMP途径的激活。提示APJ的羧基末端的突变体是通过抑制APJ的磷酸化而降低PKC增强PKA途径的。本实验利用双报告基因法检测信号通路下游的PKC(SRE)和PKA(CRE)信号。结果显示：与野生型APJ相比，突变体细胞对SRE的活性增强比野生型的要低，而且突变体A344Z和Q352Z显著的降低了SRE的活性而相对增强了CRE的活性。在所有处理的细胞中，PKC的抑制剂BisⅡ完全阻断了SRE-Iuc的活性，另外，缺失所有的羧基末端的丝、苏氨酸残基后仍然不能完全的阻断SRE的活性。　　 本研究首次利用BRET技术结合免疫共定位、免疫共沉淀等多种不同的技术手段，首次证实：(1)APJ是A型GPCRs受体；(2)APJ与β-arrestin共定位于细胞膜上，逐步向胞内移动，在细胞膜附近分离；(3)APJ借助clathrin内化；(4)C-末端对APJ的细胞内信号转导发挥重要的作用，各丝/苏氨酸残基簇对信号转导分子的影响是相互协调的。其中在APJ羧基末端的321、322和329位点对维持正常的信号转导功能最重要。深入研究APJ与β-arrestins的相互作用以及APJ的结构与功能的关系，对于深入揭示Apelin/APJ系统参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供新的依据，为apelin/APJ系统药物的开发提供新的思路，具有重要的推广应用价值。