骨疏丹原料药材指纹图谱及复方体内活性成分分析

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骨疏丹处方是基于传统中医学和现代医学对骨质疏松症的认识,利用“中药小复方精选系统操作技术平台”及“《普济方》数据库管理系统”精心拟定而成。骨疏丹方剂由淫羊藿、蛇床子、骨碎补和丹参四味中药组成。本文建立了复方骨疏丹原料药材的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,色谱柱为DiamonsilTMC18,检测波长为270 nm,柱温为25℃,流速为1.0 mL·min-1。骨碎补,淫羊藿指纹图谱流动相均为乙腈-0.4%醋酸水溶液,蛇床子指纹图谱流动相为乙腈-水,采用梯度洗脱。结果表明,淫羊藿用聚类分析可归为两类,朝鲜淫羊藿共得到23个共有峰,相似度0.8以上;骨碎补得到8个共有峰,相似度0.9以上:蛇床子得到7个共有峰,相似度0.9以上。可有效控制药材质量。本论文应用本实验室建立的成骨样细胞UMR106活性检测技术,以促进成骨细胞增殖的作用为活性检测指标,采用MTT法,测定了大鼠灌胃给予骨疏丹提取物后含药血清的活性,测得增殖率为45.1%。结果表明骨疏丹经机体吸收、代谢后对成骨细胞有一定的促进成骨样细胞UMR106增殖作用。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定大鼠组织样品中骨疏丹的活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、柚皮苷和蛇床子素的含量,考察给药骨疏丹后它们的组织分布情况。以卡马西平为内标,样品处理采用沉淀蛋白法。LC-MS/MS分析条件如下:色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18,流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脱,流速为0.25mL·min-1,柱温为40℃;质谱条件采用ESI源,正离子检测方式,多反应监测(MRM)。淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、柚皮苷和蛇床子素分别在20-400 ng·g-1,20-400 ng·g-1,100-2000ng·g-1和10-1000 ng·g-1范围内线性关系良好。结果表明淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ,柚皮苷,蛇床子素主要分布在胃、肠中,其次是肝、肾,在心、脾、肺、肾上腺、脑中未检测到各成分。本研究在中医药学理论的指导下,将中药学、分析化学、细胞分子生物学和现代信息学等多学科技术相结合,建立了骨疏丹原料药材的高效液相指纹图谱,作为骨疏丹药材的质量控制方法之一,测定了骨疏丹含药血清体外药理活性指标,研究了骨疏丹在体内的分布特征,为复方骨疏丹的研究开发提供了一定的依据。
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