桔青霉素(Citrinin，CTN)是青霉属和曲霉属等某些真菌菌株产生的真菌毒素，分子式是C13H14O5，分子量为250，其化学命名为(3R，4S)—4，6-二氢—8-羟基—3，4，5-三甲基—6-氧—3H—2-苯吡—7羧酸。桔青霉素具有良好的抑菌性，能抑制芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌，还能抗某些真菌和原生动物，对革兰氏阴性菌抑制弱。但是桔青霉素能引起许多动物的肾脏毒害，并有致癌性，因为桔青霉素的这些特性，近年来桔青霉素污染引发的包括对人在内的哺乳动物的毒害问题，越来越引起人们的关注。 桔青霉素的检测方法有多种，目前测定桔青霉素的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和免疫化学方法。其中免疫化学方法由于具有较高的灵敏度和特异性、对样品的纯度要求不高、特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛应用于各种真菌毒素的检测。免疫化学方法必须以抗体为基础，若要提高检测方法的灵敏度和特异性，关键是要得到对桔青霉素具有高度特异性和亲和力的抗体。Abramson等报道，用多克隆抗体研制的ELISA试剂可用于检测桔青霉素；2007年，刘仁荣制备桔青霉素的单克隆抗体，并建立了间接竞争酶联免疫吸附分析方法。 但是迄今为止，全世界仍未能制订桔青霉素检测的统一方法和标准，我国现在还没有建立测定桔青霉素的标准方法。其主要原因是不同国家采取的方法和标准各不相同，缺乏行之有效的分析检测方法。为了保护公众健康，必须尽快建立更加灵敏、精确、方便操作的桔青霉素检测分析方法，并制定统一的检测标准。因为卵黄抗体IgY的运用越来越广泛，但是，到目前仍没有利用卵黄抗体IgY建立检测桔青霉素的相关方法，本研究通过制备桔青霉素人工抗原免疫莱亨鸡，获得桔青霉素卵黄抗体IgY，并建立ELISA分析方法和胶体金方法，进行方法学评价。 研究方法 第一部分，桔青霉素人工抗原的合成与鉴定。采用甲醛加成法，制备并获得桔青霉素—小牛血清白蛋白(CTN—BSA)结合物，10000rpm离心15分钟去除沉淀，然后—60℃真空抽干，得到CTN—BSA产物；用同样的方法，得到CTN与OVA偶联物，即桔青霉素—卵清蛋白结合抗原CTN—OVA，最后进行真空抽干，置于-20℃保存备用。 用波长为240nm—400nm紫外光谱分析方法，对CTN，BSA，OVA，CTN—BSA和CTN—OVA同时进行扫描分析；并使用红外线光谱法对以上物质进行扫描分析；同时对合成抗原经过SDS—PAGE电泳鉴定。 第二部分，制备和纯化桔青霉素抗体IgY。使用人工合成抗原CTN—BSA免疫产卵期白莱亨鸡，第一次每只鸡注射1.0ml乳化抗原加完全弗氏佐剂，然后进行4轮半量乳化抗原加不完全弗氏佐剂的加强免疫注射，收集免疫后产卵，同时留取免疫前产卵作为阴性对照。 采用优化的Clarke方法进行桔青霉素卵黄抗体IgY纯化，用3体积4％的聚乙二醇6000溶液和3体积氯仿，稀释1体积卵黄，共进行两次沉淀，获得桔青霉素卵黄抗体IgY，然后在—60℃条件下进行真空抽干，产物置于—20℃保存备用。 使用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(Sodiumdodecylsulfate—polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)，进行桔青霉素卵黄抗体IgY鉴定。 采用ELISA检测法的方阵滴定，测定桔青霉素卵黄抗体IgY效价，用免疫前卵清蛋白作为阴性对照，确定检测抗体的最大稀释度。 桔青霉素抗体IgY稳定性试验：(1)IgY热稳定性试验，将IgY用PBS稀释成1mg/ml，分别在20℃～80℃水浴内处理20min，采用ELISA方法测定其吸光度值，检测活性；另外分2组65℃水浴30分钟、72℃15秒进行巴氏消毒，ELISA测定活性；(2)pH试验，在pH值为1～12的条件下，37℃孵育2小时后ELISA测定活性；(3)胃蛋白酶试验，将胃蛋白酶按1:3000进行稀释，用pH4.0的0.05mol/LTris—C1缓冲液将IgY稀释成1mg/ml，在100μlIgY稀释液中分别加入10μl上述胃蛋白酶溶液，37℃分别作用1～8小时后，ELISA测定活性；(4)胰蛋白酶试验：将胰蛋白酶铵1:400稀释，用PBS将桔青霉素IgY浓度稀释至1mg/ml，调整反应pH为8.0，37℃分别反应1～4h，ELISA测定活性；(5)冻融处理：冰冻于—20℃，融化于4℃，反复冻融5次，ELISA测定活性。 桔青霉素抗体IgY的特异性检测，采用ELISA试验检测桔青霉素，同时检测OTA，AFB1，PAT，DON和ZON，检测桔青霉素卵黄抗体IgY特异性。 第三部分，检测桔青霉素的间接竞争ELISA方法的建立和应用评价。使用ELISA方阵滴定法，确定最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释度；同样确定最佳酶标记二抗稀释度；建立检测桔青霉素的间接竞争ELISA的标准曲线，确定其检测限和线性范围，并且将间接竞争ELISA法和高效液相色谱法(HPLC)，进行检测桔青霉素的相关性研究，相关系数为r=0.9896；然后进行样品加标回收实验、酶标板均一性检测，平均吸光度值为A：1.357，变异系数(CV)为：3.896％，评价间接竞争抑制ELISA检测方法结果较好。 第四部分，建立胶体金标记抗体检测桔青霉素方法以及初步应用。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；取制备好的胶体金溶液，用紫外分光光度计测定制备的胶体金的最大吸收峰值，用透射电镜扫描测定制备的胶体会的形状，以判断胶体金制备效果；利用10％氯化钠加入，并用分光光度计测其在580nm处的吸光度值，测得胶体金标记抗体的最小用量，然后计算出胶体金标记抗体最适稳定量；利用波长580nm条件下测定吸光度值，选定胶体金标记抗体时的最佳pH值；采用低温超速离心法纯化胶体金标记抗体，以除去其中未标记的抗体和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。 优化试验步骤，建立竞争法胶体金标记抗体检测桔青霉素方法，鉴定其特性，包括确定其检测限为20ng/ml，将胶体金标记抗体检测桔青霉素方法与间接竞争ELISA法进行相关性比较；然后检测试制胶体金检测试纸条的性能。 主要研究结果 1、成功完成桔青霉素人工抗原合成与鉴定 使用紫外光谱分析方法和红外线光谱法，分别对CTN，BSA，OVA，CTN—BSA和CTN—OVA进行鉴定分析；由紫外线光谱鉴定图和红外线光谱鉴定图；以及对合成抗原经过SDS—PAGE电泳鉴定的实验证明，采用甲醛加成法的人工免疫抗原CTN—BSA和检测用包被抗原CTN—OVA成功合成。 2、通过免疫过程，制备和纯化桔青霉素卵黄抗体IgY，并进行抗体鉴定和特异性检测 用ELISA方法测定桔青霉素卵黄抗体IgY的效价结果显示，桔青霉素人工抗原免疫效果明显，桔青霉素卵黄抗体IgY的最高效价为1:102400，表明免疫的CTN人工抗原免疫刺激白莱亨鸡产生了针对CTN的较高的滴度特异性抗体。 桔青霉素抗体IgY的凝胶电泳(SDS—PAGE)鉴定结果显示，通过制备得到最终较纯的桔青霉素卵黄抗体IgY；桔青霉素IgY抗体特异性测试结果表明，当浓度达到10，000ng/ml时没有出现与固定抗原表面决定簇产生竞争交叉反应的其它毒素(OTA，AFB1，PAT，DON和ZON)，证明获得了特异性强的桔青霉素卵黄抗体IgY。 3、利用制备和纯化桔青霉素卵黄抗体IgY，建立间接竞争酶联免疫吸附试验定量检测桔青霉素 使用ELISA方阵滴定法，用确定最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释度，最佳包被抗原浓度为CTN—OVA10μg/ml，枯青霉素卵黄抗体IgY最大检测灵敏度的效价为1:256，同样方法确定最佳酶标记二抗稀释度为1:500。 建立检测桔青霉素的间接竞争ELISA的标准曲线，确定其检测限10ng/ml，和线性范围为20～640ng/ml；间接竞争ELISA法和高效液相色谱法(HPLC)进行检测桔青霉素的相关性较好，相关系数为r=0.9896；样品加标回收实验的平均的回收率为94.47％，平均变异系数为4.917％；酶标板均一性检测的平均变异系数为3.896％。 4、利用免疫胶体金结合桔青霉素卵黄抗体IgY，建立胶体金检测桔青霉素方法以及初步应用 采用柠檬酸三钠还原法成功制备40nm左右胶体金；紫外分光光度计测定和透射电镜扫描测定制备的胶体金的形状，显示胶体金制备效果较好；测得胶体会标记抗体最适稳定量为45ug/ml；选定的胶体金标记抗体时的最佳pH值为8.5。 优化试验步骤，建立了竞争法胶体金标记抗体检测桔青霉素方法，其检测限20ng/ml，胶体会标记抗体检测桔青霉素方法与间接竞争ELISA法的符合率为97.0％；胶体金检测试纸条的性能检测显示试纸条保存期可大于6个月。 结论： 本实验通过紫外线光谱、红外线光谱鉴定和对合成抗原经过SDS—PAGE电泳鉴定，证明了成功合成桔青霉素人工免疫抗原CTN—BSA和检测用包被抗原CTN—OVA；通过免疫动物，制备和纯化，获得了特异性强、抗体滴度高的桔青霉素卵黄抗体IgY；并且进一步建立了酶联免疫(ELISA)检测方法和胶体金标记免疫法(GICA)检测桔青霉素，通过对两种方法学评价，满足试验方法要求，可以运用到相关人体或食品等样本的桔青霉素检测中。