目的:本实验旨在研究细胞外信号调节蛋白激酶-5(ERK5)是否在体内外参与肺纤维化的发病过程,进一步研究ERK5对体外培养的人肺成纤维细胞自噬、凋亡及增殖的调控和ERK5抑制剂对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响,为肺纤维化的治疗提供新的实验依据。第一部分探讨ERK5在人肺成纤维细胞中对自噬、凋亡和增殖的调控及对人肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞(表型转化)的影响。方法:(1)用TGF-β1以10ng/m L的作用浓度处理人肺成纤维细胞(HLFs)24h,分别通过Western Blot和细胞免疫荧光检测Fibronectin和α-SMA蛋白表达水平。(2)分别用干扰ERK5基因的si RNA(si-ERK5)和过表达ERK5基因的质粒(over-ERK5)作用于HLFs,再用TGF-β1处理HLFs,通过Western Blot检测细胞内α-SMA蛋白表达水平;再分别给予自噬抑制剂和自噬激活剂处理,Western Blot检测α-SMA、LC3II、Beclin-1、p62蛋白表达水平。(3)分别用BIX02189(ERK5抑制剂)、si-ERK5、overERK5作用于HLFs,再用TGF-β1处理HLFs,通过Western Blot检测细胞内α-SMA蛋白表达水平,检测凋亡相关蛋白Bcl-2、cleaved-caspase-3表达水平,检测增殖相关蛋白PCNA表达水平;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;通过细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞增殖率。结果:(1)TGF-β1处理组与对照组相比,Fibronectin和α-SMA蛋白表达水平升高。(2)经TGF-β1处理后,ERK5干扰组与空白对照组相比,α-SMA蛋白表达水平降低;ERK5干扰+自噬抑制剂组与干扰组相比,α-SMA、p62蛋白表达水平升高,LC3II、Beclin-1蛋白水平降低;ERK5过表达组与空白对照组相比,α-SMA蛋白表达水平升高;ERK5过表达+自噬激活剂组与过表达组相比,α-SMA、p62蛋白表达水平降低,LC3II、Beclin-1蛋白表达水平升高。(3)经TGF-β1处理后,给予BIX02189(ERK5抑制剂)和si-ERK5处理后的HLFs,与相应空白对照组相比,cleaved-caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2、PCNA蛋白表达水平降低,CCK8检测到细胞增殖受到抑制,流式细胞术检测到细胞凋亡率升高;给予over-EKR5处理后的HLFs,与空白对照组相比,cleaved-caspase-3蛋白表达水平降低,Bcl-2、PCNA蛋白表达水平升高,CCK8检测到细胞增殖率升高。第二部分探讨ERK5抑制剂对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中α-SMA、LC3II表达的影响。方法:雄性C57BL/6小鼠24只,随机分为生理盐水对照组(NS组)、博来霉素+生理盐水模型组(BLM组)、博来霉素+BIX02189治疗组(BT组)和生理盐水+BIX02189对照组(BC组),6只每组。NS组和BLM组于造模当日腹腔注射100μL生理盐水,BT组和BC组腹腔注射100μL BIX02189(10mg/kg)。2小时后NS组和BC组气管内滴注50μL生理盐水,BLM组和BT组气管内滴注50μL博来霉素(3.5mg/kg)。每日观察小鼠一般状态,于28天后处死小鼠,取左侧肺组织做Masson染色和HE染色,取右侧肺组织做Western Blot检测α-SMA、LC3II蛋白表达量。结果:(1)NS组和BC组小鼠一般状态良好。BLM组和BT组小鼠状态多有下降,小鼠毛发稀疏、无光泽,呼吸急促,精神状态不佳,进食、进水减少,缺乏活力,体型较另外两组小。但BT组较BLM组小鼠状态稍好。(2)麻醉后解剖小鼠发现,NS组和BC组小鼠肺组织颜色红润,质地柔软。BLM组小鼠肺组织颜色苍白,质地较硬。BT组小鼠肺组织与BLM组小鼠相比,肉眼未见明显差别。(3)经腹主动脉放血后,取小鼠左侧肺组织做病理切片,分别做Masson染色和HE染色,NS组和BC组肺组织结构完整,无明显胶原纤维沉积和炎性细胞浸润,BLM组有大量胶原纤维沉积和炎性细胞浸润,BT组有少量的胶原纤维沉积和炎性细胞浸润。(4)经腹主动脉放血后,取小鼠右侧肺组织做Western Blot,BLM组α-SMA的蛋白表达量明显高于NS组,BT组α-SMA的蛋白表达量明显低于BLM组,BC组与NS组无明显差别;BLM组LC3II蛋白表达量低于NS组,BT组LC3II蛋白表达量高于BLM组,BC组与NS组无明显差别。结论:(1)在TGF-β1诱导的HLFs表型转化过程中,ERK5的高表达促进细胞增殖、抑制细胞自噬和凋亡。(2)ERK5促进肺成纤维细胞的表型转化,并在体内外参与肺纤维化的发生发展。(3)ERK5抑制剂BIX02189可缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的发病过程。