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姜黄素(Curcumin,Cur)是从姜黄根茎中分离得到的一种天然膳食多酚类化合物,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和促进伤口愈合等多种药理活性。研究表明,姜黄素作为抗氧化剂可以抑制多种类型癌细胞生长,包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胰腺癌和结肠癌,但对人脑胶质瘤研究甚少。少量动物模型的实验和临床研究也证明了姜黄素的抗癌作用。近期有研究发现,姜黄素发挥抗肿瘤活性可能是由于促进细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平升高,通过氧化胁迫来实现的。本文以人脑胶质瘤细胞U87为细胞模型,检测并评价姜黄素对细胞增殖、细胞活性氧水平、氧化应激指标和细胞凋亡等方面的作用,深入探讨该化合物的抗癌作用是否与其促氧化性有关,为姜黄素的临床应用及功能食品开发提供数据和理论参考。论文结果如下:1.CCK-8法检测姜黄素对细胞增殖的影响显示,姜黄素对U87细胞的增殖有明显的抑制作用,在5-100μM的浓度范围内随着姜黄素浓度的升高,U87细胞增殖率降低,呈浓度依赖性,回归分析IC50为68.32μM;台盼蓝排染法检测姜黄素对细胞致死率显示,姜黄素处理U87细胞24 h后,随着姜黄素浓度的升高对U87细胞致死率上升。结果表明姜黄素抑制U87细胞生长。2.光学显微镜下观察姜黄素处理后细胞形态学变化显示,姜黄素作用U87细胞后,可引起细胞出现胞体收缩变圆等现象,浓度越高这种变化越明显;当姜黄素与抗氧化剂5m M GSH联合处理后,细胞恢复到与对照组相似的形态,提示姜黄素引起的细胞形态变化可能和氧化作用有关。3.用DCFH-DA荧光探针和电化学法检测细胞ROS含量显示,姜黄素作用U87细胞后,胞内ROS水平上升,且加入抗氧化剂GSH后,ROS水平回落。酶联免疫标记检测细胞NADPH氧化酶活力发现,5-40μM姜黄素作用于U87细胞24 h后,与对照组相比处理组胞内NADPH氧化酶活力均升高;当NADPH氧化酶Nox1/Nox4抑制剂GKT137831联合处理后NADPH氧化酶活力降低,说明姜黄素引起胞内ROS升高可能来源于NADPH氧化酶途径。4.对氧化应激指标总抗氧化力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的检测结果表明,5-40μM姜黄素处理后,U87细胞内T-AOC显著降低,且随着姜黄素浓度升高T-AOC逐渐降低;胞内MDA水平明显升高,且呈剂量依赖性;胞内GSH水平明显降低,也呈剂量依赖性;这些结果都说明,姜黄素使得U87细胞处于氧化胁迫状态,且随着浓度的升高胁迫加重。胞内SOD水平也随姜黄素浓度升高,说明细胞氧化胁迫诱导该酶表达升高,也表明了姜黄素具有促氧化作用。5.Annexin V/PI双染后流式细胞术检测和AO/EB荧光染色检测细胞凋亡都表明:5-40μM姜黄素处理24 h后,U87细胞发生凋亡,细胞总凋亡率明显上升,呈现浓度依赖性,且10μM、40μM姜黄素分别加入抗氧化剂GSH联合处理后,会减弱姜黄素诱导的细胞凋亡,表明凋亡作用是由氧化作用导致。6.通过免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白信号通路发现,姜黄素处理使NF-κB/p65蛋白的表达水平明显下降,与5m M GSH共同处理后蛋白表达水平上升,即姜黄素引起的ROS升高可以下调NF-κB/p65蛋白的表达;检测线粒体内源性凋亡途径中相关蛋白发现:姜黄素可以升高促凋亡蛋白Bax的表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,即升高Bax/Bcl-2值;并发现姜黄素诱导的细胞凋亡可能是caspase依赖的。检测结果发现姜黄素可下调Pro Caspase-3的表达,说明相对增加了其激活形式的Caspase-3的量进而诱导了细胞凋亡。检测还发现姜黄素诱导的细胞死亡可能与焦亡相关蛋白Caspase-1有关。加入抗氧化剂GSH检测信号通路蛋白的实验结果说明,姜黄素诱导的细胞死亡是通过促氧化作用实现的。综上各项研究结果表明,姜黄素在作用于人脑胶质瘤U87细胞后,通过提高细胞NADPH氧化酶活性而促进ROS产生,引起细胞内氧化应激指标改变,T-AOC降低、MDA升高、GSH下降、SOD升高,即姜黄素处理使得U87细胞处于氧化胁迫,且随着浓度增加胁迫加重;ROS的生成,触发细胞信号通路,下调NF-κB/p65蛋白的表达,诱导线粒体内源性凋亡途径中Bax和Bcl-2的差异性表达,通过凋亡执行分子Caspase-3使细胞凋亡。