锌元素是人体内含量第二的过渡金属元素,绝大部分锌元素是结合态存在于各类蛋白中,此外还有少部分的弱结合或者自由态的Zn2+在生命体系内以锌库的形式存在。Zn2+的动态平衡与很多生理学过程密切相关比如:神经信号传递、信号转导、细胞凋亡、基因组转录等。很多重大疾病与Zn2+紊乱有着极大的关联比如:神经退行性疾病帕金森综合征、阿尔茨海默病、癌症(乳腺癌,前列腺癌等)等。因此研究体内Zn2+行为对理解Zn2+的生理学与病理学功能都具有极其重要的意义,Zn2+荧光探针法已经被证明是一种可以高灵敏度,快速响应,无损伤的Zn2+检测方法。但是用于Zn2+的活体组织造影的探针仍有需要突破的地方如,光漂白性、样品多样化以及其他会对实验结果造成较大误差的影响因素如,探针自身浓度、微环境以及检测条件。因此比例计量型Zn2+荧光探针应运而生,这种探针具有独特的双发射模式因而具有自校正能力而降低前面提到的不利因素的影响。但是目前正在意义上能够用于内源性Zn2+检测的比例计量型探针鲜有报道。另外Zn2+的生物学功能研究还需要能够对Zn2+在组织和模式动物体内的空间Zn2+分布进行研究,这就需要发展近红外探针或者双光子探针的性能才能满足对探测深度要求。而且研究大量细胞的集体Zn2+行为则需要借助于流式细胞术。本论文合成了一种基于FRET机理的新型比例计量型(Ratiometric)Zn2+荧光探针CPBT。CPBT由两部分组成,其中一部分是具有双光子激发能力的香豆素衍生物,另一部分是一个N,N,N’-三(吡啶-2-亚甲基)-乙烷-1,2-二元胺(TPEA)取代的ICT荧光团4-a氨基-7-苯璜酰[c][1,2,5]噁二唑(ASBD)。该探针的FRET效率在Zn2+螯合前后有较大的改变,可以使探针荧光发射峰由565蓝移向485 nm。使用该探针我们成功的完成了对细胞以及幼生斑马鱼的体内Zn2+比例计量造影,造影结果显示该探针能够适用于内源性Zn2+的检测。之后还利用探针完成了斑马鱼头部的3D 比例计量造影,而且发现探针造影深度达150μm。斑马鱼的头部造影3D重构图中显示斑马鱼体内游离Zn2+主要集中在耳部、前半部分的卵黄囊以及瞳仁的中心区域。此外我们还对小鼠脑部额叶区域的游离Zn2+分布情况进行了深度超过200 双光子比例计量造影。造影结果显示在造影区域内随着造影深度0-200μm存在一个Zn2+浓度高于其他区域的核心区域。利用探针CPBT发展了一种适用于大量细胞内Zn2+浓度比例计量检测的流式细胞术,及双通道(X轴绿色通道,Y轴红色通道)等密度线模式β角法。利用探针和这种方法我们发现对顺铂敏感的细胞MCF-7中的游离Zn2+浓度在顺铂刺激条件下有明显的下降,而对顺铂不敏感的细胞SKOV3中的游离Zn2+浓度在顺铂刺激的前8个小时内存在明显的增加。以上所有实验结果无论是适用于比例计量探针的流式细胞术还是3D荧光造影得到的不同生物样品内的Zn2+浓度跟踪信息均为发现新的Zn2+相关的生物过程提供了重要条件。上述研究发现顺铂处理会引起不同细胞内迥异的Zn2+浓度变化情况。另有报道与顺铂耐药性密切相关的GSH的表达水平在某些细胞内受到细胞内Zn2+浓度的调控。因此我们在胃癌细胞SGC7901与它的顺铂耐药细胞株SGC7901/DDP细胞中研究了顺铂刺激下这两种细胞内GSH的表达上调与顺铂诱导的细胞内游离Zn2+浓度变化之间的联系。利用CPBT的比例计量流式细胞术研究发现SGC7901/DDP细胞内的游离Zn2+浓度(β=51.1°)高于SGC7901细胞内的游离Zn2+浓度(β=43.2°),而且 SGC7901/DDP 细胞内的 GSH(95.1±9.2 nmol/mgprotein)水平也高于SGC7901细胞(48.4±2.4 nmol/mgprotein)。而且进一步研究发现,当使用顺铂(20 μM)刺激SGC7901细胞12小时后细胞内存在明显的游离Zn2+浓度(β=50.9±0.1°)与 GSH 水平(68.0±5.5 nmol/mg protein)上调的趋势。这一实验发现解释了 SGC7901/DDP细胞内较高的游离Zn2+浓度与较大GSH表达水平产生的原因,因为SGC7901/DDP就是通过持续增加SGC7901细胞培养环境中顺铂浓度的方式诱导而得到的。其次我们发现向SGC7901细胞内添加外源性的Zn2+也会将细胞内GSH的水平上调到72.2±6.2 nmol/mgprotein;而对同一批次的细胞使用具有良好过膜能力的Zn2+螯合剂BPEA(NⅠ,NⅠ-二(吡啶-2-亚甲基)乙烷-1,2-二胺)进行处理时细胞内的的GSH水平下降到23.2±2.0 nmol/mg protein。蛋白免疫印迹实验结果显示外源的游离Zn2+上调了 GSH合成限速酶GCLC与GS的表达水平,而且Zn2+螯合剂则下调了这两种酶的表达水平。以上的实验结果表明SGC7901细胞内的GSH的表达是经由游离Zn2+调控的细胞内GCLC与GS的表达水平来实现的。因此可以推断顺铂引起的细胞内GSH的表达上调行为是其诱导的细胞内游离Zn2+浓度增加所致。而且经过验证Zn2+螯合剂BPEA的预处理确实可以降低顺铂引起的细胞内GSH的表达增加而且螯合剂也是通过降低GCLC与GS的方式来实现的。之后我们研究发现顺铂引起细胞内游离Zn2+浓度增加与细胞内增加的ROS水平有关。通过研究我们发现ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸能够很明显的下调顺铂引起的细胞内游离Zn2+浓度增加,这意味着顺铂引起的细胞内游离Zn2+浓度增加确实与它引起的ROS变化有关。之后我们使用ICP-MS发现顺铂刺激不会引起细胞内总的锌元素的含量的变化,这表明顺铂引起的细胞内游离Zn2+浓度增是通过释放细胞内锌库或者含锌中的游离Zn2+来实现的,而细胞内的ROS则是此释放行为的实际操作者。经过进一步实验验证,我们发现顺铂处理SGC7901细胞会引起细胞内ROS水平的持续增加,虽然这种增加趋势不会被BPEA的预处理所抑制,但是顺铂引起的细胞内游离Zn2+浓度增加和GSH的水平上调确可以被很好的抑制。本章中的所有研究结果表明,在SGC7901细胞中,顺铂处理可以大大上调细胞内的ROS水平,而上调的ROS造成了细胞内游离Zn2+的释放最终导致了 GSH含量的增加,使得细胞对顺铂产生耐受。从的二部分的研究中发现锌离子螯合剂可以十分有效的减少顺铂引起的细胞内GSH的表达水平增加,而且螯合剂可能会通过降低GSH引起的耐这样的方式增加顺铂在细胞中的毒性作用。我们选着了一系列具有良好过膜能力且拥有不同锌离子配位数的螯合剂,BPA(二(吡啶-2-亚甲基)胺)、BPEA和TPEN(N,N,N’,N’-四(2-吡啶甲基)乙二胺)来掩蔽SGC7901细胞中顺铂处理引起的游离Zn2+的增加,具体方法:选择较低的螯合剂浓度(细胞存活率大于90%)预处理细胞12小时后在用顺铂来刺激细胞。之后测定了螯合剂存在条件下两种细胞对顺铂的12小时IC50。实验结果如下未经任何螯合剂预处理的SGC7901细胞的12小时顺铂IC50是25.5±1.2 μM,不同螯合剂处理条件下细胞对顺铂的2小时顺铂IC50是23.1±0.8 μM(BPA),15.8±0.5 μM(BPEA),11.0±0.4μM(TPEN);在SGC7901/DDP细胞中具体的实验结果是,≥100 μM(无螯合剂组),79.9±6.1 μM(BPA),45.9±3.4 μM(BPEA),27.3±2.6 μM(TPEN)。两种细胞内的实验结果均表明越强的螯合能力预处理引起的毒性就越大,在三种螯合剂中螯合能力最强的TPEN使顺铂在SGC7901细胞中具有最小的IC50。而且TPEN可以使顺铂在SGC7901/DDP中的IC50接近于未经螯合剂预处理的SGC7901细胞。后续的比例计量流式细胞实验发现锌离子螯合剂特别是螯合能力较强的螯合剂在SGC7901细胞内能够逆转顺铂引起的细胞内游离Zn2+浓度的增加,而在SGC7901/DDP细胞中螯合剂仅仅能做到降低顺铂上调的细胞内游离Zn2+浓度的作用。但是此时顺铂引起的ROS水平的上调的能力却被螯合剂大大增强了,特别是螯合能力强的螯合剂其作用效果就越明显。此外无论是细胞内的GSH水平还是与之合成相关的蛋白GCLC和GS的表达量均被螯合剂下调了,螯合能力强的螯合剂的作用效果尤为明显。上述所有实验结果均表明螯合剂特别是螯合能力强的螯合剂可以通过掩蔽游离Zn2+的方法来提高顺铂在SGC7901和SGC7901/DDP细胞中的毒活性。后续的实验还证明螯合剂的使用可以减缓SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性增长速度。至此本文利用探针CPBT和适合于比例计量型探针的流式细胞术发现了游离Zn2+在顺铂杀伤SGC7901细胞过程中的特殊作用,利用这样的发现一种很有前景的提高顺铂治疗效果的方法。