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蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)是本实验室从患病沼泽绿牛蛙中分离到的病毒病原,为虹彩病毒科蛙病毒属的成员。本文试图在分子水平对RGV的功能基因进行探索性研究,为病毒的防治提供理论基础。从RGV克隆到两个新基因,并对其进行了特征分析和功能探索,主要结果如下:1、对RGV 3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因进行了转录、亚细胞定位等特征分析和过量表达的功能研究。(1)RGV 3β-HSD基因的ORF全长1068bp,编码一个长为355aa,分子量大小为39.3KDa的推定蛋白。氨基酸序列同源搜索及比对表明,RGV 3β-HSD的氨基酸序列与蛙(Xenopus laevis)3β-HSD同源性最高,达到47%;其氨基酸序列中含有与3β-HSD功能密切相关的保守氨基酸和模体(motif)。(2)通过RT-PCR和5′-RACE分析表明,RGV 3β-HSD基因在感染后4h即从翻译起始密码子ATG上游第19个核苷酸处开始转录,在感染后4h至48h一直保持高水平转录。用放线菌酮(cycloheximide, CHX)和阿糖胞苷(cytosine arabinoside, AraC)进行药物抑制实验,揭示RGV 3β-HSD基因是立即早期(immediate early, IE)基因。(3)通过真核转染和荧光显微镜观察,显示RGV 3β-HSD在鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini, EPC)、肥头鲤细胞(fathead minnow, FHM)和幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney, BHK-21)中均定位于细胞质。采用两种质粒共转染和激光共聚焦显微镜观察,表明RGV 3β-HSD与细胞线粒体共定位,这是关于病毒编码的3β-HSD具有不同于脊椎动物3β-HSD的亚细胞定位的首例报道。(4)由真核转染和G418筛选得到过量表达RGV 3β-HSD的EPC细胞(EPC/pcDNA3.1-HSD)和转染空载体的EPC对照细胞(EPC/ pcDNA3.1)。经形态学观察和MTT实验,表明过量表达RGV 3β-HSD能显著抑制RGV和大菱鲆弹状病毒(Scophthalmus Maximus Rhabdovirus, SMRV)感染导致的细胞死亡。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术分析,揭示过量表达RGV 3β-HSD能够显著抑制SMRV诱导的细胞凋亡,表明RGV 3β-HSD是一个新型的凋亡抑制因子。2、对RGV增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)基因进行了基因结构、转录和细胞内定位等特征分析。(1)RGV PCNA基因的ORF全长738bp,编码一个长为245aa,理论分子量为26KDa的蛋白。氨基酸序列同源搜索显示,RGV PCNA的氨基酸序列和真核生物PCNA的同源性很低,与蛙(Xenopus laevis)PCNA同源性最高仅为18%。通过二级结构分析,表明RGV PCNA具有其它真核生物PCNA所特有的二级结构。(2)将RGV PCNA基因插入到表达质粒pET32a中,构建了原核表达重组质粒pET32a-PCNA。将其转化表达宿主菌并诱导表达,经SDS-PAGE分析,在预计大小处有明显的融合蛋白表达条带。进一步采用Ni-IDA His·Bind亲和层析柱对重组蛋白进行了纯化,获得了较高纯度的重组蛋白。用纯化的重组蛋白作为抗原免疫小鼠,制备了鼠抗RGV PCNA抗血清。(3)通过RT-PCR和western blot分析表明,RGV PCNA基因在感染后4h即开始转录并合成蛋白,并且在感染后4h至48h持续进行转录及合成蛋白。CHX和AraC药物抑制实验表明,RGV PCNA基因是晚期(late, L)基因。(4)通过真核转染和荧光显微镜观察,表明RGV PCNA在EPC、FHM、BHK-21三种细胞内均分布于细胞质中。进一步采用免疫荧光细胞化学显示,在病毒感染后的细胞中,RGV表达的PCNA特异性的与病毒装配位点的病毒核酸共定位,表明RGV PCNA可能是一个与病毒核酸相互作用的蛋白。