三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)是我围最重要的淡水育珠母蚌。本研究构建了三角帆蚌外套膜和血淋巴cDNA文库，采用EST技术筛选与珍珠形成及免疫相关基因，筛选多态性的EST-SSR，并筛选组织间稳定表达的管家基因。然后根据珍珠形成相关基因的EST序列，获得基因的全长cDNA序列及基因组DNA序列，筛选这些基因的多态性SSR、SNP和CNV标记，分析这些分子标记与三角帆蚌生长性状的相关性，并将这些标记用于三角帆蚌遗传结构分析。本研究为三角帆蚌珍珠形成机制的研究提供了基础性资料，为三角帆蚌种质资源和分子标记辅助育种研究提供了新型分子标记。　　 1.三角帆蚌外套膜cDNA文库构建和珍珠形成相关基因筛选　　 构建了1个三角帆蚌外套膜cDNA文库用以筛选珍珠形成相关基因。从文库挑取克隆并测序，共获得5129个EST序列，经拼接后获得了620个重叠群(Contig)和1151条单一序列(Singleton)。通过BLAST分析，发现44.7％的Unique序列被注释成己知的功能基因，55.3％的Unique序列未被注释任何功能；根据序列相似性，发现了29个与珍珠形成相关的基因，包括5个钙代谢相关基因、12个细胞外基质蛋白基因和12个细胞骨架蛋白基因。　　 2.三角帆蚌血淋巴cDNA义库构建和免疫相关基因筛选　　 构建了1个三角帆蚌血淋巴cDNA文库用以筛选免疫相关基因。从文库挑取克隆并测序，共获得5290个EST序列，经拼接后获得了481个重叠群(Contig)和1165条单一序列(Singleton)。通过BLAST分析，发现46.5％的Unique序列被注释成己知的功能基因，53.5％Unique序列未被注释任何功能；根据序列相似性，发现了50个与免疫防御功能相关的基因，根据其功能，这些免疫相关基因可被分为7类，即13个免疫过程蛋白基因、5个压力蛋白基因、6个粘着蛋白基因、7个蛋白酶和蛋白酶调节子基因、3个抗菌肽基因、6个溶酶体酶基因和10个细胞凋亡调节蛋白基因。　　 3.两个三角帆蚌钙调蛋白基因的克隆及其多态性分析　　 克隆了两个三角帆蚌钙调蛋白基因CAM1和CAM2，两基因cDNA序列全长分别为840bp和1，297bp，包括80bp和83bp的5’-末端非转录区(5’-UTR)，310bp和764bp的3’-末端非转录区(3’-UTR)。两基因均含有450bp的开放阅读框(ORF)，编码149个氨基酸，无信号肽序列，含有4个EF手型钙离子结合结构域。两个钙调蛋白基因编码区序列的一致性为85％，而推导的氨基酸序列一致性和同源性分别为89.93％和95.97％，说明这两个基因为两个不同的钙调蛋白基因。CAM2基因组序列全长4643bp，由4个外显子和3个内含子组成，内含子序列包含两个微卫星标记以及23个SNP标记。利用23个SNP标记，分析了4个三角帆蚌群体：鄱阳湖野生群体(PY)、洞庭湖野生群体(DT)、诸暨养殖群体(ZJ)和都昌养殖群体(DC)的遗传结构。结果表明4个群体遗传多样性水平较低，全部遗传差异来自于群体内部，群体间遗传分化不显著。聚类结果显示，PY和ZJ群体首先聚类，之后与DC群体聚类，最后与DT群体聚在一起。瓶颈效应分析巾，无限等位基因模型(IAM)分析结果显示PY和两个养殖群体遗传杂合度呈显著过剩，逐步突变模型(SMM)分析结果显示只有ZJ遗传杂合度呈显著过剩(P＜0.05)。　　 4.三角帆蚌铁蛋白基因克隆、拷贝数目多态性及其与生长性状的相关性分析　　 铁蛋白基因cDNA序列全长为822bp，包括153bp的5’-末端非转录区，525bp的开放阅读框和144bp的3’-末端非转录区，基因组序列全长4125bp，由四个外显子和三个内含子组成。共编码174个氨基酸，无信号肽序列，推测的蛋白包含一个高度保守的铁氧化活性巾心结构域，该结构域由7个与脊椎动物H型铁蛋白完全一致的氨基酸残基组成；还包含一个保守的铁离子结合相关残基(Try27)和一个铁离子结合区域标识1。该铁蛋白基因转录的mRNA在5UTR区存在一个27bp的铁调节区域(IRE)，该区域形成典型颈环结构。在实时定量PCR技术基础上，采用3UTR区锚定引物克隆单克隆位点作为内参，建立了铁蛋白基因拷贝数分析方法，分析了三角帆蚌鄱阳湖野生群体和金华养殖群体(JH)铁蛋白基因拷贝数多态性及其与生产性状的关系。结果表明，在PY和JH中，铁蛋白基因的二倍体拷贝数分别为6-12和3-6之间，PY遗传多样性高于JH;在JH中，4个拷贝数基因型的三角帆蚌壳长高于3个拷贝数基因型的壳长(P＜0.1)，说明铁蛋白基因与壳长生长显著相关，是提高三角帆蚌生长率的有用的选育分子标记。　　 5. EF手形钙结合蛋白和组织蛋白酶L基因的克降和序列分析　　 EF手形钙结合蛋白基因cDNA序列全长为1，286bp，包括161bp的5’-末端非转录区，543bp的开放阅读框和582bp的3’-末端非转录区，共编码180个氨基酸，无信号肽序列，含有3个EF手型钙结合结构域。BLAST分析结果显示，该蛋白与其他几种双壳贝类的EF手形钙结合蛋白的一致性均达到55％以上，同源性均达到70％以上，其巾与菲律宾蛤仔的同源性最高，达到82％。　　 组织蛋白酶L基因cDNA序列全长为1，105bp，包括24bp的5’-末端非转录区，1，002bp的开放阅读框和79bp的3’-末端非转录区，共编码333个氨基酸，包含一个由20个氨基酸组成的信号肽。该蛋白前体肽具有组织蛋白酶前体抑制因子功能结构域，组织蛋白酶L家族高度保守结构基序ERFNIN[E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]，以及GNFD和GCXGG基序；该蛋白的半胱氨酸类蛋白酶半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸活性位点均高度保守。　　 6.三角帆蚌多态性EST-SSR标记的开发　　 从三角帆蚌表达序列标签巾共筛选出410个微卫星序列。在二碱基重复类型中，AG/CT重复类型最多，占70.04％，或者说占总微卫星数的40.49％。在三碱基重复类型中，AAT/ATT重复类型最多，占50.00％，或者说总微卫星数的19.76％。所有微卫星序列巾，有116个序列具有足够长的侧翼序列用以设计引物，其巾60对引物成功获得了目的PCR产物，并且31个微卫星位点是多态性的。每个多态性位点的等位基因数位于6-26之间，表观杂合度和期望杂合度分别位于0.042-1.000之间和0.737-0.969之间。　　 7.三角帆蚌组织差异表达分析实时定量PCR内参基因的筛选　　 从EST序列中筛选出β-actin、β-tubulin、elongation factor1 alpha(eflα)、GAPDH、ubiquitin、ribosomalproteinL18(Rp118)以及cyclophilin共7个持家基因，采用geNorm软件分析了其在不同组织间表达稳定性。结果表明，组织间表达变化最大的是β-actin基因，而最稳定的两个基因是GAPDH和Rp118，两基因的成对变异值为0.058，所以不需要第三个基因作为内参基因。　　 8.三角帆蚌育珠性能和生长性状的关系　　 研究了同1个母蚌后代三角帆蚌产珠性能与生长性状的关系。结果表明：珍珠单重、粒径、直径差百分比、产珠量和圆珠率这5个指标的极差以及变异系数很大，说明子代个体间在育珠性能方面出现较大分化，可通过选育进行改良。与产珠量的相关性巾，壳质量＞体质量＞壳高＞壳宽＞壳长；与珍珠粒径的相关性中，壳质量=体质量＞壳宽＞壳高；与直径差百分比的相关性巾，壳宽＞壳质量=体质量；与圆珠率的相关性中，壳宽＞壳质量＞体质量。结合生产可操作性，体质量和壳宽应作为两个最主要选育性状；位于外套膜外侧的珍珠质量明显高于内侧(P＜0.05)，但未发现左壳与右壳间珍珠质量具有显著性差异(P＞0.05)。