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目的: 心脏发育从最初的心肌层、心内膜和血管内皮前体细胞的特化,到这些细胞分化迁移形成具有跳动功能的器官是一个动态且及其复杂的过程。这一系列事件都受到精细的调控,即使再轻微的心脏发育改变也很容易造成极其严重的心脏缺陷甚至胚胎或胎儿的死亡。因此先天性心脏病在人出生缺陷中是最常见也是最严重的。越来越多的证据表明引起先天性心脏病的基因实际上在早期心脏发育过程中都起了非常重要的作用。像参与心脏发育的转录因子GATA4和HAND2在心脏发育中都是极其重要的。GATA4错义突变会导致房间隔缺损、室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄和房室间隔缺损;转录因子HAND2的突变会导致法乐氏四联征、肺动脉瓣狭窄、房室间隔缺损和室间隔缺损。但是这些基因在先天性心脏病中的发病机理,其背后的机制,以及在早期心脏发育中是如何被精细调控的,我们还知之甚少。因此,探究在心脏发育过程中的未知基因或己知基因的未知功能,及对这些基因的精细调控,能让我们对先心病复杂的发病机理有更清晰的认识。 钙离子(Ca2+)是细胞内最重要且多功能的第二信使,在心脏发育过程中扮演着重要角色,但是Ca2+具体是如何被精细调控以及如何影响其下游基因的表达和心脏发育的,目前还并不十分清楚。心肌细胞精确维持细胞内的钙水平是至关重要的,而这一过程就需要对钙转运蛋白的严格调控。细胞膜上的Na+/Ca2+交换体(NCX)能将胞内的钙排出到胞外。ncx1h(ncx基因家族的一个亚型)是在心脏发育过程中最先表达的功能基因之一,ncx1纯合缺陷小鼠在胚胎发育9.5天就会死亡,虽然已知其参与兴奋收缩耦联的调控,但在早期心脏发育过程中生理作用、精细调控和下游目前并不清楚。 所以本文旨在筛选和发现参与调控心脏发育的新基因,或者己知基因的新功能和新调控,我们以斑马鱼为模型通过正向遗传学筛选获得了心脏特异表达的ncx1基因(又名ncx1h)的一个新突变位点,结合敲低和挽救等实验研究其在早期心脏发育中新的作用及下游信号通路。 方法: 首先通过诱变剂建立一个斑马鱼的突变体库,通过正向遗传学方法,在胚胎受精后36小时观察心脏表型并在48小时以心肌特异基因cmlc2为探针进行全胚胎原位杂交,筛选出心脏发育异常的突变体,通过定位克隆找到引起突变表型的突变基因ncx1h。通过敲低ncx1h验证表型与突变体一致。进一步通过CRISPR/Cas9技术构建,ncx1h的新的突变,通过互补分析从遗传学的角度证实ncx1h就是引起突变表型的基因。最后通过显微注射下游基因的mRNA进行过表达,使表型得以恢复。 结果: 1.从52家候选家系中筛选出20家循环均受影响的心脏发育异常突变体。其中lO家心脏环化异常,5家心脏变小,4家心脏变大和l家心脏形态正常但收缩弱。 2.命名为LDD353的突变家系的纯合突变胚胎,与野生型相比,在受精后33小时(33hpf,33hours post fertilization),出现心胞肿,无循环,在36hpf心脏收缩明显弱、无规律且不同步,在48hpf出现心脏面积小,成长条状,心率慢,房室管标志基因表达异常头眼偏小,但血管发育无明显异常;72hpf定向造血缺失,5dpf鳍发育异常. 3.ncx1h是引起LDD353突变家系突变表型的基因,461位T到C的突变使第154位亮氨酸突变为脯氨酸,突变位点位于保守的与钠离子结合的结构域,ncxlh是心脏特异表达的非母系来源的基因,在纯合突变体中并未出现表达缺失;敲低ncx1h的表达能完全重复出突变体的表型,通过CRISR/Cas9构建的,ncx1h突变体具有ncx1h基因错义突变一致的表型。 4.进一步的机制研究发现,在突变体中心脏变小的原因来自于心室肌细胞数的变少,但心房细胞数没有差异,心室肌细胞数的变少并不是由于增值减少或凋亡增加造成的。心室肌细胞数的减少起始于24hpf-36hpf之间。过表达hand2基因及其上游基因gata4可以部分恢复ncxlh引起的心脏异常表型;ncxlh突变会引起胞内基础钙水平上升,并使胞内钙的上升相和下降相速率变慢,但通过抑制阻断经典的钙相关的信号通路(Calcineurin-NFAT和CaMKⅡ)并不能有效恢复突变表型。 结论: 本论文首次发现心脏特异表达的ncx1h基因新的突变位点,第46l位T到C的突变(造成154位保守结构域中的亮氨酸突变为脯氨酸)使基因正常功能被破坏,导致胞内基础钙水平上升,使钙的转运速率变慢,心率变慢;机制研究发现ncx1h基因突变在引起心肌细胞收缩异常的同时,房室管也发育异常,心脏面积变小。进一步研究发现在突变体中心室肌细胞数目特异性减少,但心房肌细胞数不受影响。当过表达hand2基因及其上游基因gata4可以部分恢复ncx1h基因引起的心脏异常表型。本论文丰富了我们对Na+/Ca2+交换体l(NCXl)功能和下游通路的认识,首次提出ncx1h基因在早期心脏发育中很可能参与调控gata4和hand2的表达从而调控心脏形态发生,揭示了ncx1h在心脏发育中新的作用,也为NCX1h基因功能异常引起的先心病的治疗提供了新的思路。