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[背景]冠状动脉疾病是我国主要的公共健康问题之一,严重威胁国民的健康和经济,由于成年心肌细胞缺乏再生能力,瘢痕组织将会替代梗死后的心肌组织,导致左心室功能降低和心脏结构的重塑。尽管药理学、心内冠脉介入和心脏外科手术水平的医学进展降低了心血管疾病的急性期死亡率,但目前的治疗尚未能提供理想的心肌细胞再生策略;诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell iPSCs)具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells ESC)相似的全能性,但iPSC不涉及伦理,其来源广泛,为科学家探索疾病的发生及发展的病理生理学机制提供了一个全新的平台。近些年ESC来源外泌体(exosome)与心肌修复之间的相关研究较多,可能的机制是通过旁分泌发挥其作用,外泌体作为一种细胞联系的载体,其中含有独特的生物活性物质,可作为细胞间信使和表观遗传调节因子,发挥生物学功能。由于iPSC诱导技术完善、无免疫源性、其多向分化的能力而被普遍应用于心肌修复的手段。iPSC的多能性将能够从任何人体组织细胞产生外泌体,并允许对退行性疾病进行广泛的治疗,通过个性化iPSC生物学的无细胞临床实施来转化精确医学。本研究设想 iPSC 来源的外泌体(Induced pluripotent stem cells derived iPSC-Exo)在受损的心肌细胞中是否同样有着抗细胞凋亡、坏死、重塑、纤维化、促血管生成及促进心肌修复的作用。[研究目的]1.从iPSC无血清培养上清液中提取外泌体及其鉴定;2.构建大鼠心肌细胞氧化应激损伤体外实验模型,探索iPSC-Exo对受损的H9C2细胞的疗效;3.构建SD大鼠急性心肌梗死模型,建立完整的分析、评价体系,为探索iPSC-Exo治疗急性心肌梗死的实验疗效提供动物模型基础。[实验方法]1.使用超高速离心方法从iPSC无血清的培养基上清液中提取出外泌体,使用透射电镜观察外泌体的形态特征;纳米颗粒追踪技术对外泌体的粒径进行测量;Western Blot检测外泌体表面上的标记蛋白分子CD9、CD63、CD81以及TSG101是否表达。2.H9C2经一定浓度及作用时间的过氧化氢溶液损伤后将细胞培养上清液收集,检测乳酸脱氢酶升高,表明模型制备成功;细胞活力检测实验:检测受损H9C2经iPSC-Exo干预后H9C2细胞的活力;通过Western blot检测iPSC-Exo干预受损H9C2细胞后Caspase3、Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达情况。3.SD大鼠,随机分三组,手术气管切开插管后,于大鼠左侧第4肋间横切口开胸,直视下结扎左冠状动脉前降支,造成左室前壁心肌梗死,观察数分钟后心肌内注射iPSC-Exo;观察心梗模型构建成功与否:心电图检查;术后数小时内ST段抬高作为心肌梗死模型成功的标志;术后3小时肌钙蛋白的升高;术前、术后1天、术后1周及术后4周予以大鼠心脏超声检查;4周后处死大鼠,病理切片后予以HE染色、Masson染色观察心肌纤维化情况、免疫荧光评估iPSC-Exo组疗效(抗凋亡、新生血管形成)。4.统计学方法:本研究采用成组t-检验分析干预组与对照组差异,运用SPSS(22.0)及GraphPad Prism 6.0进行数据统计,P<0.05表示具有统计学差异。[实验结果]1.iPSC-Exo的提取和鉴定1.1采用聚乙二醇-8000(PEG-8000)沉淀法可以稳定的分离出iPSC-Exo,再经蔗糖密度梯度离心法纯化获得iPSC-Exo,经鉴定后符合外泌体的理化特性,可用于后续实验;2.H9C2心肌细胞体外损伤模型的建立及iPSC-Exo的疗效分析2.1 H202干预H9C2心肌细胞可做为理想的心肌梗死体外实验模型;2.2 iPSC-Exo能够增强H9C2心肌细胞对H202作用的抵抗;2.3 iPSC-Exo处理能够减少H202诱导的H9C2心肌细胞凋亡;2.4 iPSC-Exo减少H9C2心肌细胞凋亡可能与线粒体途径介导的凋亡有关。3.SD大鼠AMI模型的建立及iPSC-Exo的疗效评估3.1经心电图、超声心动图、组织学等方法证实结扎SD大鼠冠状动脉前降支可成功建立AMI模型;3.2 iPSC-Exo能够改善AMI后大鼠心功能;3.3 iPSC-Exo能够减少AMI大鼠心肌组织细胞的凋亡;3.4 iPSC-Exo能够增加AMI大鼠心肌组织内新生血管;[研究结论]一.聚乙二醇-8000沉淀法可以稳定的分离出iPSC-Exo,再经蔗糖密度梯度离心法纯化获得iPSC-Exo,经鉴定后符合外泌体的理化特性。二.H202干预H9C2心肌细胞可做为理想的心肌梗死体外实验模型;iPSC-Exo能够增强H9C2心肌细胞对H202作用的抵抗,细胞活力增强及减少H9C2心肌细胞凋亡;三.结扎SD大鼠冠状动脉前降支可成功建立AMI模型;iPSC-Exo能够改善AMI后大鼠心功能、减少心肌组织细胞的凋亡、增加心肌组织内新生血管。四.iPSC-Exo可以作为心肌损伤修复的一种潜在治疗方法。