研究背景:垂体腺瘤（Pituitary adenoma,PA）近年来发病率呈上升趋势,据报道其发病率仅次于胶质瘤。虽然垂体腺瘤的组织学特征是良性的,但在临床工作中,约有25-55%的垂体腺瘤向周围结构侵袭性生长,复发率高,与恶性肿瘤相似,手术难以彻底切除,它们被定义为侵袭性垂体腺（aggressive PA）[1]。虽然目前有一些药物疗法可用于治疗某些类型的垂体腺瘤,但不同患者对这些药物的敏感性不一,且更多的是控制肿瘤分泌激素,难以根除肿瘤。因此,控制垂体腺瘤的侵袭性是目前临床治疗的一个难题,阐明其发病机制将有助于开发新的临床治疗方法。随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展,RNA测序（RNA-seq）已成为基因表达和转录组分析新的重要手段,其定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点使RNA-seq测序成为当下流行的转录组学测序技术。于是我们尝试探索转录组学与侵袭性垂体腺瘤（侵袭性PA）之间的关系,期望寻找与其侵袭发生密切相关的靶标分子。在转录组学测序基础上,我们根据GEO数据库分析发现,Pannexin-1（Panx1）是与垂体腺瘤的发生发展有着密切联系,Panx1一种存在于细胞膜上的通道,具有独特的传导性,从非选择性离子渗透性到信号分子的胞外释放,对于影响细胞的生物学行为发挥着重要的作用。Panx1在肿瘤发生、癫痫等疾病发生发展过程中起到重要作用[2]。有意思的是,研究发现,在不同类型肿瘤中Panx1的作用却不尽相同。例如,在胶质瘤C6细胞中,Panx1发挥着抗肿瘤的作用[3],而在皮肤黑色素瘤中却扮演促进肿瘤发生的角色[4]。这样的现象可能是由于肿瘤起源特异性、特殊肿瘤微环境所致。Panx1主要通过在细胞膜上形成大孔径通道,而非细胞间缝隙连接通道发挥生理功能,Panx1通道开放可导致细胞与胞外微环境代谢物质交换[5],这些物质可能影响细胞侵袭性生物学行为,Panx1的ATP、氨基酸释放特性影响着肿瘤细胞的生物学行为已经在许多报道中得以证实。此外,在中枢神经系统中,Panx1在神经元和胶质细胞上都有表达,被认为可以介导细胞间的连接和相互作用。而在垂体腺瘤中,Panx1与其侵袭性的发生是否相关尚不得而知,因此,本研究旨在探索Panx1在侵袭和非侵袭垂体腺瘤中的表达情况和影响垂体腺瘤侵袭的发生机制,为临床治疗侵袭性垂体腺瘤提供新的方法,为进一步的机制研究提供新的理论基础。方法:1、收集6个GH腺瘤样本（侵袭和非侵袭各3例）,进行转录组学测序。2、收集56个垂体腺瘤样本（侵袭和非侵袭各28例）,分别用RT-q PCR和免疫组化方法检测Panx1m RNA和蛋白的表达。3、在体外,利用来源于大鼠的垂体腺瘤细胞系--GH3细胞探究Panx1对垂体腺瘤细胞增殖、侵袭能力的影响及其分子机制。结果:1、侵袭性和非侵袭性GH腺瘤中存在众多差异基因表达我们收集了6例GH腺瘤标本,按Knosp分级,将其分成侵袭和非侵袭各3例。通过转录组学测序检测两组m RNA和lnc RNA的表达。结果表明,侵袭性GH腺瘤和非侵袭性GH腺瘤（侵袭性GH-PA和非侵袭GH-PA）中有多个m RNAs和lnc RNAs表达不同,它们可能是调控垂体腺瘤侵袭的潜在生物标志物或药物靶点。其次,根据转录组学结果和数据库分析,在所有差异基因中,我们筛选到细胞膜通道Panx1与垂体腺瘤的侵袭性密切相关。2、Panx1在侵袭性垂体腺瘤中表达上调并且促进GH3细胞侵袭为了进一步验证Panx1与垂体腺瘤侵袭性之间的关系,我们扩大了样本量,增加了垂体腺瘤的类型,收集了56例垂体腺瘤样本,根据Knosp分级（Knosp分级≥3级为侵袭）将它们分成了两组,侵袭组和非侵袭组。运用RT-q PCR方法检测了Panx1在两组的表达量,结果表明与非侵袭组相比,侵袭组Panx1的表达明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）。同样地,免疫组学结果表明Panx1在侵袭组表达量更高。然后,我们在GH3细胞过表达Pannexin-1后,与对照组（Vector）相比,Panx1过表达组（Panx1-OE）明显促进了GH3细胞的侵袭。3、Panx1通过增加ATP释放促进GH3细胞侵袭通过检测细胞外ATP含量,我们发现过表达Panx1会促进GH3细胞释放ATP,增加细胞外ATP含量,然而当用Panx1阻断剂（丙磺舒,Probenecid,PBN）孵育GH3细胞后,细胞外ATP含量明显下降。其次,向Panx1-OE组GH3细胞中加入ATP酶（ATPase）降解胞外ATP后,GH3侵袭能力则大大减弱;同样地,向Vector组GH3细胞中加入ATP类似物（Bz ATP）后,GH3细胞的侵袭能力又再次增强（P<0.05）。以上结果表明,Panx1通过增加ATP释放来促进GH3细胞系的侵袭。4、Panx1介导的ATP释放通过激活P2X受体促进钙离子的内流我们利用非特异性P2X受体拮抗剂（PPADS）、特异性P2X4和P2X7受体拮抗剂（5-BDBD和JNJ-47965567）处理Panx1-OE组GH3细胞时,它们均显著抑制了GH3细胞的侵袭（P<0.05）,尤其是JNJ-47965567,这表明P2X7在促进GH3细胞侵袭中起着更重要的作用。此外,通过钙成像实验,我们发现P2X7受体的激活增加了钙的内流,显著GH3细胞的侵袭,而P2X受体特异拮抗剂（JNJ-47965567）则可以逆转这一结果。这一系列结果均提示,Panx1介导的ATP释放通过激活P2X7受体促进钙离子的内流。5、细胞内钙离子增加重塑actin细胞骨架蛋白促进GH3细胞侵袭通过分别加入P2X7受体激动剂（Bz ATP）和拮抗剂（JNJ）,对细胞内细胞骨架蛋白的状态进行观察,其次干扰肌动蛋白细胞骨架来检测GH3细胞侵袭的变化。我们发现,细胞内钙离子的增加可以直接作用或通过钙调蛋白激酶间接作用于细胞actin骨架蛋白,导致其形态、活性发生改变,进一步促进GH3细胞的侵袭。结论:1.Panx1在侵袭性垂体腺瘤中表达上调,并且促进GH3细胞侵袭。2.Panx1增加胞外ATP激活P2X7受体重塑肌动蛋白细胞骨架促进GH3细胞侵袭。