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研究目的:通过大鼠血清建立干细胞移植治疗肝衰竭体外模型,进行骨髓间充质干细胞培养。观测在肝衰竭环境中间充质干细胞的增殖、分化及免疫调节情况,以及在肝衰竭环境中清热解毒凉血化瘀法对间充质干细胞的影响。进一步从细胞层面探索在肝衰竭环境中清热解毒凉血化瘀法与间充质干细胞的协同作用。研究方法:1、大鼠BMSCs分离、培养及传代筛选:从3-4周龄SPF级SD大鼠骨髓中提取、分离、培养BMSCs。运用全骨髓培养法及传代筛选法进行细胞培养及纯化。当细胞增殖达到80~90%时,进行传代、扩增。细胞传代到第3代时用于进一步的检测及移植。通过细胞形态学及流式细胞仪鉴定证明实验所得细胞为BMSCs。2、实验血清的制备:将30只大鼠分为模型组及健康组,模型组21只大鼠通过腹腔注射D-Gal N制造肝衰竭大鼠模型。48h后随机从模型组和健康组各抽取大鼠3只,采集肝组织进行病理切片,验证造模成功。再将模型大鼠14只平均分为中药干预组和肝衰竭组,中药干预组予以肝毒清颗粒灌胃,肝衰竭组和健康组予以等剂量生理盐水灌胃。3组大鼠灌胃3天后,腹主动脉采血并分离血清,过滤除菌,制备成中药干预血清、肝衰竭血清、健康血清,置于-20℃冰箱保存备用。3、建立肝衰竭模拟环境下骨髓间充质细胞培养体系,采集并检测相关指标将第3代BMSCs接种于96孔板、6孔板及24孔板中,各设立3个实验组,分别加入健康血清、肝衰竭血清、中药干预血清进行BMSCs培养。96孔板中培养BMSCs,每组设3个复孔,分别在培养1d,2d,3d时终止培养,进行CCK-8检测,使用酶标仪检测数据进行定量分析。观察BMSCs的增殖存活情况。24孔板中培养BMSCs,每组设3个复孔,做爬片处理,培养10d后,终止培养,并制作CK18免疫荧光爬片。通过免疫荧光显微镜检测BMSCs肝向分化情况。6孔板中培养BMSCs,每组设3个复孔,培养10d后,终止培养,提取细胞蛋白,并通过Western blot法检测甲胎蛋白(AFP)、肝组织白蛋白(ALB)、吲哚胺2,3—双加氧酶(IDO),分析BMSCs肝向分化及免疫调节活性。研究结果:1、将BMSCs置于各组血清中培养1天、2天时,CCK-8检测结果显示:健康组、肝衰竭组、中药干预组,组间差异无统计学意义;第3天时,CCK-8检测结果示:健康组与肝衰竭组,健康组与中药干预组的组间差异均有统计学意义,而肝衰竭组与中药干预组之间无统计学差异。但在细胞培养10天后观察发现,中药干预组细胞生长明显优于肝衰竭组。2、BMSCs制作细胞爬片,培养10天后进行CK18免疫荧光检测。结果显示健康组染色为阴性,肝衰竭组及中药干预组染色为阳性,后者染色较强,但均明显弱于肝细胞染色。推测BMSCs肝向分化过程中细胞分化数量或细胞成熟度较低。3、BMSCs培养10天后通过Western blot法检测相关蛋白表达。ALB蛋白表达结果显示:健康组、肝衰竭组、中药干预组均有表达,且依次递增,各组之间有统计学差异,但其表达量较少。AFP蛋白表达结果显示:健康组、肝衰竭组、中药干预组表达强度依次增强,各组间差异有统计学意义。4、BMSCs培养10天后通过Western blot法检测IDO表达,结果显示:健康组IDO蛋白无明显表达。IDO蛋白在中药干预组中的表达高于肝衰竭组,且两组间差异具有统计学意义。研究结论:通过建立BMSCs移植治疗肝衰竭体外模型,观察发现BMSCs在肝衰竭环境中增殖活性相对下降,具有肝向分化趋势,及免疫调节活性。清热解毒凉血化瘀中药在肝衰竭环境中对BMSCs的增殖在短时间内无明显作用,但可以促进干细胞分化,且明显提高干细胞免疫调节活性。