研究背景流行病学调查显示,胃癌位居因恶性肿瘤而引起大量患者死亡的病因中的第二位,是全世界第四大常见恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康。虽然一般的传统观念认为,胃癌属于雌激素非依赖性肿瘤,但男女发病率之比接近2：1-3：1,越来越多的流行病学调查结果显示,胃癌展现出了一种神秘的以男性为主的现象。女性绝经期后,这种差异消失,除了雌激素水平,任何一种其他已知的危险因素,都难以解释这种差异。女性月经初潮年龄越早,绝经期越晚,胃癌发病越晚,而绝经后胃癌发病增加。从月经初潮到绝经期前,有多次生育经历的女性,胃癌发病率低,而修女中胃癌的患病率偏高。口服避孕药及雌激素替代治疗能降低胃癌发病率,且给予雌二醇治疗的男性前列腺癌患者,胃癌的发病率远远低于没有给予雌二醇治疗的男性前列腺癌患者。接受卵巢切除术的女性,胃癌发病率增加,而给予雌激素替代治疗者,胃癌发病率下降。近期流行病学调查的结果还显示,雌激素水平与胃癌的组织学类型有一定的关联。肠型胃癌好发于中老年男性,女性肠型胃癌的发生比男性普遍延后10-15年,而女性绝经期后,肠型胃癌的发病率增加。上述证据提示,雌激素与胃癌的发生发展之间显然存在相关性,但是目前并不清楚其相互关系的机制。动物实验的研究结果也显示,对于雄性和雌性大鼠,同时给予化学致胃癌药物1-甲基-3-硝基-1亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)刺激,雄性大鼠胃癌发病率高于雌性大鼠。暴露于同等MNNG条件下的雄性大鼠,给予雌激素治疗组胃癌发病率远远低于未给予雌激素治疗组。暴露于同等MNNG条件下的雌性大鼠,去除卵巢组胃癌发病率远远高于未去除卵巢组。而且,在无雌激素保护的用MNNG诱导出胃粘膜上皮不典型增生的大鼠中,重新给予雌激素治疗后,可以逆转胃粘膜的癌前病变。因此,从人类流行病学调查的结果及动物实验研究的证据可以获得以下科学推论,女性绝经期前的雌激素水平对胃癌的发生起到一定的抑制作用,即所谓雌激素的保护性作用。这种保护性机制是如何实现的一直不清楚。这是本文将研究的内容之一,即雌激素对胃癌的发生与发展起什么作用以及通过了什么关键途径。己知雌激素至少包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)以及雌四醇(E4)等,其中雌二醇的生物学活性最强,分别是雌酮及雌三醇的3倍和10倍,也是目前雌激素替代治疗的主要药物成分之一。E2通过雌激素受体(estrogen receptor, ER)发挥作用。ER至少包括ER-α和ER-β两个亚型,其中ER-α又包括ER-α66(传统意义上的ER-α)、ER-α46和新近发现的ER-α36等三个亚型。在未发现ER-α36以前,以往的研究表明,胃癌组织中ER-α和ER-p的表达不高,并且变异比较大(胃癌组织中ER-α的阳性率为2-28%),并且对ER-α(ER-α66)阳性的胃癌患者给予tamoxinfen治疗,并没有取得与乳腺癌一致的疗效。因此,质疑雌激素以及雌激素受体介导的信号在胃癌中发挥作用的推论。ER-α36是ER-α(ER-a66)的亚型,ER-α36的第一个启动子位于ER-α66的第一个内含子中,缺乏ER-α66的两个转录激活域(AF-1和AF-2),但是保留了DNA结合域,部分的受体二聚化域及配体结合域。ER-α36的氨基酸序列已经很清楚,由310个氨基酸组成,分子量35.7KD。其基因编码序列位于人类染色体6q24.2-25.3(GenBank Accession No. AL078582),其蛋白质主要定位于细胞膜上因ER-α36拥有一段特有的氨基酸序列,使得研究该蛋白的作用变得更为容易。现己证实ER-α36参与了包括胃癌等多种雌激素非依赖肿瘤以及人类多种疾病的发生与发展。本研究的前期研究有以下发现,在胃癌细胞和人体胃癌样本中首次报道检测到ER-α36的表达,ER-α36mRNA和ER-α66mRNA在胃癌细胞株BGC823,SGC7901, AGS, MKN45中均有表达,胃癌细胞中ER-α36表达量高于ER-α66。人胃癌组织中, ER-α36mRNA在癌组织中的表达量要高于癌旁组织和正常组织,ER-α66mRNA的表达量则呈现相反的趋势。ER-α36蛋白在胃癌组织中表达量最高,且与肿瘤的浸润深度以及淋巴结转移相关。ER-α36定位于胃癌细胞的细胞膜和细胞浆。基于上述的研究发现,本论文将主要解决以下这三个问题,第一,不同浓度的雌激素对胃癌细胞的生长与侵袭是否有影响。第二,雌激素是否可以通过ER-α36发挥作用,即不同浓度的雌激素对胃癌细胞的生长与侵袭的影响是否与ER-α36有关联；第三,雌激素对胃癌细胞的生长与侵袭是否通过src (c-src)信号通路而实现,即E2-ER-α36-src信号流在胃癌细胞的生长与侵袭中的作用及机制。第一部分胃癌组织中ER-α36-src的表达及临床病理参数相关性的研究研究目的探讨ER-α36的表达与胃癌临床病理参数的相关性,研究胃癌组织中ER-α36和src蛋白的表达,验证ER-α36在胃癌中发挥重要作用的理论推测,提供ER-α36与src信号在胃癌中的证据。研究方法收集江大病理诊断所的人体胃癌组织样本95例,应用常规组织学技术、组织芯片技术、免疫组织化学技术及western blot技术检测ER-α36和src蛋白的表达。研究结果50岁以上男性与女性相比,ER-α36表达无显著统计学差异(P>0.05)；50岁以上男性与50岁以下男性相比,ER-α36表达无显著统计学差异(P>0.05)；肠型(48例)与弥漫型(29例)胃癌的ER-α36表达有显著差异(P<0.01),即肠型胃癌高表达ER-α36；所有95例标本,肿瘤浸润情况分析结果显示ER-α36阳性表达的肿瘤侵袭能力更强(P<0.05)；肿瘤淋巴结转移情况分析结果显示ER-α36阳性表达的肿瘤,区域淋巴结转移更多见(P<0.01)。ER-α36阳性表达部位在细胞浆和细胞膜,src阳性表达部位在细胞浆,ER-α36及src的表达具有相关性(R=0.748,P<0.05),肠型胃癌与弥漫型胃癌的ER-α36及src表达均有差别,肠型胃癌ER-α36及src表达比弥漫型胃癌中的表达高(P值均<0.05)。Western blot结果显示,肠型胃癌与弥漫型胃癌ER-α36表达有显著差异(P<0.01)。结论ER-α36与胃癌组织学分型、浸润、淋巴结转移有相关性：绝经期后女性与男性胃癌ER-α36表达情况相似。ER-α36与肠型胃癌的关系更加密切。ER-α36与src的表达有相关性。第二部分ER-α36与胃癌细胞的增殖与侵袭研究目的通过检测Cyclin D1、E-cadherin、MMP2及MMP9在裸鼠移植瘤中的表达,研究ER-α36表达水平不同的SGC7901细胞增殖能力及侵袭相关标志蛋白的变化,以及src蛋白的变化,在体内研究的层面进一步论证ER-a36-src与胃癌细胞增殖及侵袭的相关性。研究方法收集普通RPMI1640培养的实验室前期成功构建的High36(稳定高表达ER-a36的SGC7901细胞株)、Low36(稳定沉默ER-a36的SGC7901细胞株)和SGC7901三种细胞株,提取蛋白,检测Cyclin D1、E-cadherin、MMP2及MMP9的表达。用SGC7901、High36及Low36三种细胞株建立裸鼠移植瘤模型,观察三种细胞株形成的移植瘤的大小、重量、增殖与侵袭等。用常规形态学技术、免疫组织化学技术以及western blot技术检测移植瘤的形态学变化、移植瘤细胞的增殖和侵袭相关蛋白的表达情况。研究结果在三株细胞中,ER-α36与Cyclin D1、MMP2及MMP9表达具有一致性,在High36中最高, Low36中最低,而E-cadherin与之相反。Cyclin D1、E-cadherin、 MMP2及MMP9在High36与Low36中的表达与对照组SGC7901相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。3组裸鼠均在第8d开始出现肉眼可见的瘤结节,至30d时处死裸鼠,取下肿瘤组织,High36组的肿瘤重量(g)为2.58±0.014,明显大于SGC7901组1.32±0.0245和Low36组0.471±0.021,差异具有显著性(P<0.05)；从肿瘤体积变化来看,至24d时,3组间的肿瘤体积大小出现明显差异,High36组的肿瘤体积明显大于SGC7901组和Low36组(P<0.05)。移植瘤细胞呈巢状、弥漫分布,间质稀少、血管丰富,部分区域形成腺管样结构,瘤细胞核仁明显,核分裂像多见。High36组核分裂像为42.33±6.33/10个高倍视野,明显高于SGC7901组28.5±0.35/10个高倍视野和Low36组12.5±2.5/10个高倍视野,差异具有统计学意义(P<0.05)。肝脏、肺脏及脑组织：组织结构存在,均未见癌细胞。免疫组织化学结果显示,High36组肿瘤组织中,ER-a36蛋白表达为(++),SGC7901组ER-a36蛋白的表达为(+)、Low36组几乎不表达ER-α36蛋白。High36组肿瘤组织中,src蛋白表达为(++)、SGC7901组src蛋白的表达为(+)、Low36组几乎不表达src蛋白。每100个肿瘤细胞中,High36组Cyclin D1细胞阳性数为79.5±4,明显高于SGC7901组58.5±3.5和Low36组21.25±2.5,差异具有统计学意义(P<0.05)。High36组每100个肿瘤细胞中Ki-67阳性细胞数为86.5±5.25,明显高于SGC7901组的65.5±4.5和Low36组的18.25±2.5,差异具有统计学意义(P<0.05)。High36组肿瘤组织中几乎不表达E-cadherin蛋白(-)、SGC7901组E-cadherin蛋白的表达为(+)、Low36组E-cadherin蛋白表达为(++)。Western blot结果显示,High36组肿瘤组织中,ER-a36蛋白的表达最高,其次是SGC7901组,Low36组表达最低。差异具有统计学意义(P<0.05)。High36组肿瘤组织中,Cyclin D1蛋白的表达最高,其次是SGC7901组,Low36组表达最低。差异具有统计学意义(P<0.05)。High36组肿瘤组织中,E-cadherin蛋白的表达最低,其次是SGC7901组,Low36组表达最高。差异具有统计学意义(P<0.05)。结论上调ER-α36(?)表达可促进胃癌细胞增殖与侵袭。在裸鼠移植瘤中,High36组胃癌细胞的增殖与侵袭能力最强,提示ER-α36的表达与胃癌细胞增殖与侵袭相关。上调ER-α36的表达,src表达也上调,提示二者相关联。第三部分E2-ER-α36对胃癌SGC7901细胞增殖的影响研究目的研究E2β(17β-Estradiol, E2β)对SGC7901、High36和Low36细胞生长的影响,观察E2β处理SGC7901细胞后,ER-α36、ER-α66及CyclinD1蛋白表达变化,在细胞水平验证胃癌细胞的增殖能力是否与E2-ER-α36有关。研究方法用5μM和0.1nM的E2β及抗ER-α36抗体处理SGC7901、High36和Low36细胞株,用细胞计数板计数,研究细胞增殖能力；用western blot方法检测ER-α36、 ER-α66、Cyclin D1蛋白表达变化。研究结果给予0.1nM E2β处理SGC7901细胞,可促进其生长,与不给予E2β处理的SGC7901细胞相比(11d),差异明显(P<0.05)。给予5μM E2β处理SGC7901细胞后(11d),细胞数量明显低于不给予E2β处理的SGC7901细胞,差异明显(P<0.05)。给予0.1nM E2β处理的SGC7901细胞数量明显多于给予5μM E2β处理的SGC7901细胞数量(11d),差异有统计学意义(P<0.05)。给予0.1nM E2β处理High36及Low36细胞(以空载体转染的SGC7901细胞为对照),在第11d时,细胞数量也出现差异,High36组最高,对照组及SGC7901细胞组次之,Low36组最低(P值均<0.05)。给予5μM E2P处理High36及Low36细胞(以空载体转染的SGC7901细胞为对照),在第11d时,细胞数量也出现差异,High36最高,对照组及SGC7901细胞次之,Low36组最低(P值均<0.05)。不给予E2β处理,用不同浓度(0μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml)的抗ER-α36抗体封闭SGC7901细胞的ER-a36后,各组细胞之间互相对比(11d),细胞数量均无统计学差异(P值均>0.05)。给予0.1nME2β处理的SGC7901细胞,同时用抗ER-α36抗体封闭ER-α36, SGC7901细胞生长有时间依赖关系和剂量依赖关系,0.1μg/ml和0.5μg/ml的抗体封闭组分别与1μg/ml的抗体封闭组相比(11d),SGC7901细胞数量有明显差异,抗体浓度越高,SGC7901细胞数量越少(P值均<0.05)；同时给予0.1nME2β处理SGC7901细胞,0.1μg/ml和0.5μg/ml的抗体封闭组与不给予抗体封闭组相比(11d),0.1μg/ml和0.5μg/ml浓度的抗ER-α36抗体封闭不能有效抑制0.1nM E2β促进SGC7901细胞生长效应,与无抗体封闭组相比(11d),三者细胞数量差异不明显(P值均>0.05),而1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体封闭组细胞数量明显减少,与不给予抗体封闭组相比(11d),细胞数量有明显差异(P<0.05)。给予5μME2β处理的SGC7901细胞,与不给予E2β处理的SGC7901细胞相比(11d),前者细胞数量少(P<0.05)。给予5μM E2β处理SGC7901细胞,同时用1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体封闭ER-α36后,与不给予E2β处理的SGC7901细胞相比(11d),前者细胞数量少(P<0.05)。给予5μM E2β处理SGC7901细胞与给予5μM E2β和1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体封闭ER-α36处理SGC7901细胞相比(11d),两者细胞数量差异不大(P>0.05)。给予0.1nM E2β处理的High36细胞,与不给予E2β处理的High36细胞相比(11d),前者细胞数量明显增多(P<0.05)。给予0.1nM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-a36抗体处理High36细胞,与不给予E2β处理的High36细胞相比(11d),前者细胞数量依然增多(P<0.05),但是与给予0.1nM E2β处理的ER-α36细胞相比(11d),前者细胞数量少(P<0.05)。给予5μM E2β处理的High36细胞,与不给予E2β处理的High36细胞相比(11d),前者High36细胞数量少(P<0.05)。给予5μM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体处理的High36细胞,与不给予E2β处理的High36细胞相比(11d),前者细胞数量少(P<0.05)。给予5μM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体处理的High36细胞,与给予5μM E2β处理的High36细胞相比(11d),两者细胞数量接近(P>0.05)。给予0.1nM E2β处理的Low36细胞,与不给予E2p处理的Low36细胞相比(11d),前者细胞数量多(P<0.05)；给予0.1nM E2β处理的Low36细胞,与给予0.1nM E2β和1μg/ml浓度的抗ER-a36抗体处理的Low36细胞相比(11d),前者细胞数量多(P<0.05)；给予0.1nM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体处理的Low36细胞,与不给予E2β处理的low36细胞相比(11d),两者细胞数量接近(P>0.05)。给予5μM E2β处理的Low36细胞,与不给予E2β处理的Low36细胞相比(11d),前者细胞数量少(P<0.05)；给予5μM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-a36抗体处理的Low36细胞,与不给予E2β处理的Low36细胞相比(11d),前者细胞数量少(P<0.05)；给予5μM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体处理Low36细胞,与给予5μM E2β的low36细胞相比(11d),两者细胞数量接近(P>0.05)。给予0.1nM E2β处理的SGC7901细胞与给予0.1nM E2β处理的Low36细胞相比(11d),SGC7901细胞数量多于Low36细胞(P<0.05)；给予0.1nM E2β及1μg/ml浓度的抗ER-α36抗体处理的SGC7901细胞与给予0.1nM E2β处理的Low36细胞相比(11d),两者细胞数量没有显著差异(P>0.05)。给予0.1nM E2β处理SGC7901细胞6h、12h、24h、48h,ER-α36、Cyclin D1表达呈上升趋势,ER-α66表达呈下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)；给予5μM E2β处理SGC7901细胞6h、12h、24h、48h, ER-α36、Cyclin D1表达呈下降趋势,ER-α66表达呈上升趋势,差异明显(P<0.05)。提取High36及Low36细胞(以空载体转染的SGC7901细胞为对照)中的蛋白,检测ER-α36、ER-α66、Cyclin D1的表达。结果显示,在三株细胞中,ER-α36与Cyclin D1表达具有一致性,即在High36中最高,Low36中最低,ER-α66与之相反。ER-α36、ER-α66及Cyclin D1在High36与Low36中的表达与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示：0.1nM E2β促进SGC7901胃癌细胞生长,51μM E2β抑制SGC7901胃癌细胞生长。上调ER-α36表达,胃癌细胞增殖加快。0.1nM E2β促进ER-α36、Cyclin D1的表达,抑制ER-α66的表达,5μM E2β的效应正好相反。ER-α36和Cyclin D1的表达水平具有一致性,与ER-α66表达水平正好相反。结论低浓度E2(0.1nM E2β)通过持续上调Cyclin D1的表达促进胃癌细胞生长,而ER-α36则介导了该效应。5μM E2β的作用效应则反之。ER-α36对ER-α66的表达有调控作用。第四部分E2-ER-a36对胃癌SGC7901细胞侵袭的影响研究目的研究E2β(17(3-Estradiol, E2p)对SGC7901、High36和Low36细胞侵袭能力的影响；观察E2β处理SGC7901细胞后,E-cadherin、MMP2及MMP9蛋白表达变化,在细胞水平验证胃癌细胞的侵袭能力与ER-α36的表达有关。研究方法用0.1nM E2p或5μM E2β处理SGC7901、High36和Low36细胞株,用Transwell实验观察细胞侵袭的改变,用、western blot方法检测E-cadherin、MMP2及MMP9蛋白表达情况。研究结果0.1nM E2β处理SGC7901细胞后,MMP2(?)口MMP9表达呈上升趋势,E-cadherin表达呈下降趋势；5μM E2β处理SGC7901细胞后,MMP2和MMP9表达呈下降趋势,E-cadherin表达呈上升趋势。SGC7901、High36及Low36三株细胞中,MMP2与MMP9表达具有一致性,在High36中最高,Low36中最低,而E-cadherin与之相反。Transwell实验结果显示,当不给予雌激素处理,High36细胞侵袭能力最强(101±6.5/每个高倍视野),Low36细胞侵袭能力最弱(63±2.5/每个高倍视野),SGC7901细胞居中(81±4.25/每个高倍视野)。0.1nM E2β可促进SGC7901细胞侵袭(109±3.25/每个高倍视野),并且明显高于5μM E2β组(43±1.5/每个高倍视野)。给予0.1nM E2β处理,High36组细胞侵袭能力最强(147±2.25/每个高倍视野)、SGC7901组次之(109±3.25／每个高倍视野)、Low36组最低(85±1.25/每个高倍视野),三组细胞差异显著(P值均<0.05)。5μM E2β组的胃癌细胞侵袭能力明显低于0.1nM E2β组,但仍以High36细胞侵袭能力依然最强(76±1.5/每个高倍视野)、SGC7901组次之(43±1.5/每个高倍视野)、Low36组最低(42±2.25/每个高倍视野)(P值<0.05)。结论低浓度E2β(0.1nM)通过下调胃癌细胞的E-cadherin表达,上调MMP2和MMP9的表达,促进胃癌细胞侵袭,并且高于高浓度E2β(5μM)的作用。上调ER-α36的表达,促进胃癌细胞侵袭,下调ER-α36的表达,胃癌细胞侵袭能力降低。提示低浓度E2β(0.1nM)以及ER-α36在胃癌细胞侵袭中发挥重要作用。第五部分胃癌细胞中E2-ER-α36-src信号流的作用及机制研究目的论证E2通过ER-α36及src信号通路(E2-ER-α36-src信号流)在胃癌细胞增殖和侵袭中发挥重要作用的机制。研究方法用不同浓度E2β处理SGC7901细胞株,用western blot方法检测src蛋白表达变化。研究SGC7901、High36和Low36细胞株中src蛋白表达差异。用0.1nME2β和／或10μPP2(src激酶抑制剂)处理,观察SGC7901、High36和Low36生长的变化,对src活性的影响；用免疫共沉淀方法研究ER-a36及src是否存在相互作用。用0.1nM E2β和／或10μM PP2,处理SGC7901、High36和Low36细胞株,观察Cyclin D1的表达。用0.1nM E2β和／或10μM PP2,处理SGC7901、 High36和Low36细胞株,用Transwell实验观察细胞侵袭的变化。研究结果给予0.1nM E2β处理SGC7901细胞6h、12h、24h、48h后,src表达呈上升趋势,与0h组相比,差异有意义(P<0.05)；5μM E2β处理SGC7901细胞6h、12h、24h、48h后,src表达呈下降趋势,分别与0h组相比,差异有意义(P<0.05)。在三株细胞中,src在High36中最高,Low36中最低,而SGC7901居中,差异具有统计学意义(P<0.05)。给予10μM PP2处理细胞,可抑制0.1nM E2p处理下的所有细胞增殖,10μMPP2分别阻断High36组和Low36组的68.91%和91.56%的细胞增殖。用针对src特异性磷酸化位点(Tyr416和Tyr527)的抗体进行Western blot分析显示,0.1nM E2β诱导了src的Tyr416磷酸化的激活,同时src的Tyr527磷酸化水平降低。10μM PP2抑制了由0.1nM E2β诱导的Tyr416磷酸化和同时增加了src的Tyr527磷酸化水平。 Src的Tyr416磷酸化表达水平与ER-α36的表达水平相关。当用E2β处理SGC7901, ER-α36与src可以直接作用,PP2不能抑制之,但可以抑制src的活化。单独用PP2处理时,ER-α36与src的没有直接的相互作用,在SCG7901组和High36组,0.1nM E2β上调CyclinD1(?)勺表达水平,而在Low36组中,01nM E2β不能诱导Cylin D1的表达。10μM PP2并没有改变E2β诱导的ER-a36表达。10μM PP2通过抑制src激酶活性,阻断了E2β诱导的CyclinD1表达。当用E2β或E2β和PP2处理SGC7901, ER-α36与src可以直接作用。单独用PP2处理时,ER-α36与src没有直接的相互作用,当用PP2处理时,抑制src的活化,P527-src表达增高和P416-src表达减低。当用0.1nM E2β和10μM PP2联合处理SCGC7901, P527-src的表达高于P416-src。当同时给予0.1nM E2β和10μM PP2处理SGC7901、High36及Low36细胞,三组细胞的侵袭能力均被抑制。但侵袭能力仍以High36组最高(48±1/每个高倍视野)、SGC7901组其次(31±1.25／每个高倍视野),Low36组最低(17±0.25/每个高倍视野)。结论E2p-ER-a36-src信号流在胃癌细胞增殖与侵袭中发挥了重要作用。