目的自噬（Autophagy）在心肌缺血/再灌注（Myocardial Ischemia Reperfusion，MI/R）过程中起着一定的作用，特别是在再灌注期。吗啡（Morphine，Mor）能够保护再灌注损伤的心肌。本研究通过形态学和分子生物学手段探讨再灌注诱发自噬的分子机制，观察吗啡是否通过抑制自噬来减轻心肌再灌注损伤，探讨吗啡抑制自噬的分子机制。方法本研究通过Langendorff系统建立大鼠离体心脏缺血/再灌注模型，采用伊文思蓝（Evans Blue）加TTC（Trimethyl Tetrazolium Chloride，TTC）双染法测定心肌梗死面积同时检测模型建立是否成功，通过电子显微镜观察自噬及自噬溶酶体的发生，在缺血/再灌注不同时间点取心脏标本通过Western blot法检测自噬标志性蛋白LC3的表达，以明确自噬发生的时期。在再灌注前5min给予吗啡，再灌注2h结束时测定心肌梗死面积并通过光学显微镜观察不同处理条件下心肌组织切片变化，验证吗啡对再灌注心肌的保护作用。选取自噬变化最显著的时间点的组织标本进行Western blot检测，分析LC3、Beclin1以及p-mTOR等蛋白的表达，以明确吗啡发挥心肌保护作用是否抑制了自噬的发生并初步探讨吗啡抑制自噬的分子机制。结果1本实验对不同时间点离体大鼠心率和冠脉流出量及心肌梗死面积进行测定，结果显示：与稳定期相比，大鼠心率和冠脉流出量在缺血期明显下降，在再灌注早期有所增加，心肌梗死面积较小；随再灌注时间的延长心率和冠脉流出量逐渐降低，长时间（120min）再灌注梗死面积显著增加，达到41.27±4.45%，与缺血期及再灌注早期相比有统计学差异（P <0.05）。证实了心肌在缺血/再灌注过程中心脏功能明显降低，心肌发生梗死，模型制备成功。2电子显微镜观察各时间点心肌组织超薄切片，能够看到各个时间点都有自噬发生，不仅能够看到典型的自噬现象，也可以看到包裹着线粒体的单层膜结构的自噬溶酶体。3Western blot检测自噬标志性蛋白LC3在I/R中的表达，结果显示与Sham组相比，无论是在缺血30min还是再灌注不同时期LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均有增加，再灌注60min时增加最明显。这一结果表明缺血和再灌注都能使自噬增加，然而再灌注早期自噬增加最为显著。4Western blot检测自噬正性调控蛋白Beclin1在I/R中的表达，结果显示与Sham组相比，I/R组Beclin1水平无明显变化，而Western blot检测I/R对自噬负性调控蛋白mTOR磷酸化的影响，结果显示与Sham组相比，无论是在缺血30min还是再灌注不同时期mTOR的磷酸化水平均有所降低，特别是再灌注30min和60min，mTOR的磷酸化水平降低可以促进自噬，说明再灌注诱发自噬可能与正性调节机制无关，而是通过负性调节机制发挥作用。5于再灌注前5min给予吗啡处理，结果显示：与I/R组相比心率和冠脉流出量明显增加，心肌梗死面积显著降低，同时HE染色结果也显示与Sham组相比I/R组心肌细胞排列比较稀松，细胞间隙增宽，细胞水肿，还可见部分肌纤维断裂；而吗啡后处理组与I/R组相比，损伤程度明显减轻，以上结果证实吗啡能够保护再灌注损伤的心肌。6选取再灌注60min观察吗啡后处理对自噬的影响。Western blot结果显示，与Sham组相比，I/R组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加，吗啡后处理组与I/R组相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著降低，但与Sham组相比没有显著差异。此结果表明吗啡可以抑制再灌注诱发的自噬。进一步检测吗啡后处理对自噬正性调控蛋白Beclin1的表达和负性调控蛋白mTOR磷酸化的影响，结果显示，与Sham组相比I/R组mTOR磷酸化水平显著降低，吗啡后处理组与Sham组相比mTOR的磷酸化水平无统计学差异，但显著高于I/R组。而各组间Beclin1的表达均无统计学差异，提示吗啡可能通过负性调控机制而非正性调控机制抑制再灌注诱发的自噬。结论在离体大鼠心脏模型中，再灌注损伤可以明显诱发自噬。吗啡可能通过负性调节机制抑制自噬并减轻缺血/再灌注损伤，从而发挥心肌保护作用。