目前,猪呼吸系统疾病已成为我国许多规模化猪场和农村养猪大户十分关注的问题。猪的呼吸道疾病被认为是困扰猪场生产经营的主要问题之一,是造成最大经济损失的疾病。 猪呼吸系统疾病是多种因素综合作用的结果,除了传染性、环境以及管理因素等以外,还包括遗传因素。对猪肺组织炎症抗性的基因表达调控和分子机制目前还不是很清楚,本研究旨在通过分离和克隆与猪肺组织炎症抗性相关基因的探索性研究,初步揭示参与肺组织炎症抗性的基因种类和数量,为进一步深入开展肺组织炎症抗性的分子机理研究及将米通过遗传选择提高肺组织炎症的抗性提供理论基础。 1:本实验中首先应用抑制性消减杂交(SSH)技术成功构建了猪病变肺组织与健康肺组织著异表达cDNA文库。以大白猪为材料,通过SSH方法技术初步筛选到部分基因差异表达序列,并将这些序列产物纯化后与pGM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞进行文库扩增,最终构建得到了具有高消减效率的猪肺组织炎症抗性相关cDNA文库。文库扩增后得到422个白色阳性克隆,随机挑选21个克隆进行PCR鉴定,鉴定结果表明插入片段主要分布在150-500bp之间。 2:随后将从抑制性消减杂交过程中筛选到的初步差异表达的基因片段,经过反Northern斑点杂交技术从消减cDNA文库中高通量筛选得到422个差异表达的克隆。分别用地高辛标记猪病变肺组织和无病变肺组织cDNA作为杂交探针,对构建的cDNA消减文库利用反向Northern斑点杂交技术筛选了41个差异表达克隆,测序后得到34个满意的EST序列。 3:根据在GenBank非冗余核酸数据库(nr)和EST数据库中BLASTn序列比对结果,将这些ESTs分为2类:第一类代表已知基因,共12个;第二类代表已知EST,共22个。代表已知基因的ESTs按照基因功能分为六类:信号转导与细胞间通信、细胞结构与运动、细胞与机体防御、物质转运、翻译与表达调控及其它。 4:结合相关文献初步探讨了部分猪肺组织炎症抗性相关差异表达基因的作用和意义,其中猪免疫球蛋白重链基因(LOC396781)、核转录因子—κB基因(NF—κB)、补体分子C1_q基因(C1QC)、钙粒蛋白B基因(S100A9)(calgranulin B gene)、平滑肌激动蛋白基因(ACTA2)、核糖体蛋白基因(RPS11) (RPS20)等基因可能在猪肺组织炎症抗性中发挥重要作用,但是这些基因之间通过何种方式相互作用促进肺组织炎症的发生还不十分清楚,有待进一步研究。