【摘 要】
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目的:应用生物信息学方法挖掘高渗及炎症因子作用下椎间盘的关键差异表达基因,探讨其富集的主要信号通路及相互作用网络。明确高渗微环境下自噬及弹性反应增强子结合蛋白（Ton EBP）在椎间盘组织中的表达情况,探讨Ton EBP参与高渗对自噬调控的分子机制。方法:在GEO数据库中下载渗透压、IL-1β、TNF-α作用后的椎间盘基因表达谱芯片数据,采用R语言分别筛选数据集中的差异表达基因,利用Me V、DA
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81572169）；
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目的:应用生物信息学方法挖掘高渗及炎症因子作用下椎间盘的关键差异表达基因,探讨其富集的主要信号通路及相互作用网络。明确高渗微环境下自噬及弹性反应增强子结合蛋白（Ton EBP）在椎间盘组织中的表达情况,探讨Ton EBP参与高渗对自噬调控的分子机制。方法:在GEO数据库中下载渗透压、IL-1β、TNF-α作用后的椎间盘基因表达谱芯片数据,采用R语言分别筛选数据集中的差异表达基因,利用Me V、DAVID、STRING、Enrichr等对其进行生物信息学分析。基于以上分析结果,利用吖啶橙染色、内源性LC3免疫荧光、Western Blot等从组织水平和细胞水平检测高渗透压对椎间盘内自噬水平及Ton EBP的影响;加入Bafilomycin A1阻断自噬小体与自噬溶酶体结合,检测高渗对自噬潮的影响;利用m Cherry-EGFP-LC3慢病毒转染髓核细胞,动态观察高渗对自噬潮的影响;检测Ton EBP敲除后m TOR/ULK1及自噬相关蛋白的变化,探讨Ton EBP在高渗调控自噬中的作用。结果:（1）GSE1648中高渗组与等渗组比较共筛选出111个差异表达基因,其中上调28个,下调83个;信号通路富集为Erb B信号通路、自噬调节等;转录因子预测富集为活化T细胞核因子（NFAT）、MYB等。GSE27494数据集中IL-1β处理后共筛选出差异表达基因324个,其中上调187,下调个137;信号通路主要涉及凋亡、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路等;转录因子富集为NF-κB、JUN等。GSE41883中TNF-α作用后的退变椎间盘芯片共筛选出753个差异表达基因,其中上调458个,下调295个;信号通路富集为细胞因子-细胞因子受体相互作用、凋亡、趋化因子信号通路等;转录因子富集为NF-κB、STAT1等。（2）高渗刺激体外培养的椎间盘后,并未引起自噬相关蛋白表达的明显变化,同样的现象在细胞水平实验中也类似;Ton EBP在体外培养的椎间盘髓核中有表达,并且高渗能进一步促进其在髓核组织表达升高;在细胞水平,不同渗透压,不同作用时间高渗刺激能引起细胞水平Ton EBP表达的变化,但对自噬相关蛋白影响不大,而加入Baf A1阻断自噬小体与溶酶体结合时,LC3II及SQSTM1水平发生变化;高渗作用后,吖啶橙染色结果显示髓核细胞内酸性囊泡数量没有明显变化;组织水平及细胞水平LC3染色显示LC3阳性的自噬小体数量并没有因为渗透压的增高而增多;Tandem m Cherry-EGFP-LC3转染显示高渗微环境下髓核细胞LC3绿色/黄色、红色荧光无明显变化,Baf A1处理后高渗环境下绿色/黄色荧光数量增加、红色荧光数量减少;Ton EBP敲除后高渗作用下自噬相关蛋白SQSTM1水平上升,同时自噬上游信号通路m TOR/ULK-1ser757发生变化。结论:（1）渗透压作用于椎间盘可能激活的信号通路主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、自噬调节信号通路等;对转录因子的预测提示NFAT、MYB转录因子可能在相互作用关系网络中起重要作用。炎症因子可能通过NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路等参与椎间盘退变;（2）椎间盘组织内存在较高水平的自噬,高渗未能进一步促进髓核细胞内自噬水平的升高;高渗可能通过影响自噬潮,维持髓核细胞内自噬水平的稳态;高渗对自噬稳态的调节可能通过Ton EBP/m TOR/ULK-1ser757信号通路。
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