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本研究根据已发表的猪瘟石门毒株序列设计了2对引物(PC1、PC2;PC3、PC4),利用RT-PCR方法扩增出猪瘟病毒石门株(F114代)核衣壳基因(C基因),并将其克隆到线状克隆载体pGEM—T easy载体上。采用随机引物法制备了地高辛标记的核酸探针,建立了猪瘟病毒原位RT-PCR方法,其敏感性可达到1pg。 应用建立的原位Rt—PCR方法对猪瘟兔化弱毒和石门强毒在猪体内进行了系统的定位研究。猪瘟石门强毒在接种后4天病毒已经完成在扁桃体、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏等组织的吸附和少量复制,接种后7天至16天病毒在扁桃体、肠系膜淋巴结、脾脏、肾脏、肝脏中大量复制并导致多种组织血管内皮严重损伤出血,自接种后2天至死亡血液中持续存在病毒。接种后2天猪瘟兔化弱毒首先吸附扁桃体、肠系膜淋巴结、脾脏,4天后吸附并感染肝脏,接种后7天才在肾脏发现病毒分子,到接种后20天,上述脏器均均未发现病毒。猪瘟兔化弱毒在血液中持续时间为接种后二天至16天,20天后无病毒分子。 同时分别利用兔体交互免疫试验和直接荧光抗体染色技术对猪瘟兔化弱毒和石门强毒在猪体内的分布与原位RT-PCR进行了平行试验,结果原位RT-PCR法与兔体交互免疫试验检测猪瘟兔化弱毒的符合率为66.7%,原位RT-PCR法与直接荧光抗体染色(触片和冰冻切片)检测猪瘟石门强毒的符合率分别为84%和88%,冰冻切片与触片直接荧光抗体染色两者符合率为80%。 分别测定接种猪瘟兔化弱毒与石门强毒和阴性对照三组猪血液生理生化指标,两两进行了生物统计检验并比较其变化规律。接种猪瘟兔化弱毒(A组)和猪瘟石门强毒(B组)猪血液生化指标只有白蛋白(ALB)差异显著,其生理指标白细胞(WBC)、中性粒细胞(GR)、淋巴细胞(LY)数据不足,其他均无显著差异。接种猪瘟石门强毒(B组)猪与阴性对照(C组)猪生化指标只有尿素氮(BUN)差异显著,其生理指标差异显著的是中性粒细胞分布(GR%)、血小板总数(PLT)、血小板体积(PCT)。接种猪瘟兔化弱毒(A组)与阴性对照(C组)猪生化指标只有直接胆红素(TBIL)差异显著,接种猪瘟兔化弱毒(A组)与正常(C组)生理指标只有血小板体积(PCT)差异显著。 本文在国内首次建立原位RT-PCR法检测猪瘟病毒RNA分子在组织细胞内的定位,在分子水平上研究猪瘟石门强毒与猪瘟兔化弱毒的致病机理。该方法对研究猪瘟持续感染的致病机理有重要意义。本实验第一次较为系统比较了接种猪瘟石门强毒和猪瘟兔化弱毒在不同时间血液中各生理生化指标的变化,从病生理学角度研究猪瘟致病机理。