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研究背景及目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染是影响全球人类健康的重要疾病,HBV慢性感染是形成人类肝细胞癌的主要致病因素。HBV基因组含有4个开放读码框架(open reading frame, ORF),即S、C、P和X区。其中,X区在HBV基因组的第1374-1838位核苷酸,长约465个碱基,是HBV基因组中最小的ORF,其编码的x蛋白(即乙型肝炎病毒x抗原,HBxAg)与乙型肝炎肝硬化(以下简称为乙肝肝硬化,liver cirrhosis, LC)、原发性肝细胞癌(Primary hepatocellular carcinoma, HCC)的发生具有明显的相关性。由于HBV复制体系独特,在慢性感染者免疫压力等因素作用下,HBV经常发生突变。研究发现由HBV导致的HCC患者体内的HBV突变率比无症状携带者(asymptomatic carrier, ASC)体内病毒突变率明显增高,其中最常见的突变类型是A1762T／G1764A双突变。由于A1762T／G1764A双突变位于核心启动子(core promoter, CP)编码区,目前许多学者认为A1762T／G1764A双突变在一定程度上影响到CP的活性。但是,由于HBV基因组中编码区具有高度重叠性,A1762T／G1764A双突变正好引起了HBxAg第130位和131位氨基酸的改变。这种改变很可能会导致HBV蛋白结构和功能的变化,继而影响到HBV相关性肿瘤的发生和疾病的进展。因此,我们构建野生型和A1762T／G1764A双突变型乙型肝炎病毒X基因原核表达系统,表达并纯化2种抗原,即HBxAg-野生及HBxAg-突变,同时制备2种抗原相应的兔抗血清,为深入研究HBVX基因及其双突变后对HBV慢性感染者病情发展和肿瘤发生的作用奠定基础。方法：从慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA,经PCR扩增和基因测序,证实并获得野生型及A1762T／G1764A双突变型HBVX基因。应用TA克隆及亚克隆技术将2基因分别插入pGEX-6P-2载体,构建pGEX-6P-2-HBV Xw(野生型)及pGEX-6P-2-HBV Xm(A1762T／G1764A双突变型)重组表达载体；转化入宿主菌进行诱导表达；包涵体复性后,GSTrap FF蛋白纯化柱纯化带有GST标签的野生型和A1762T／G1764A突变型HBV x抗原(HBxAg);应用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法对表达的野生型和双突变型HBxAg进行鉴定；分别制备兔抗HBxAg-野生及HBxAg-突变多克隆抗体(HBxAb-野生,HBxAb-突变),应用ELISA方法对2种抗体分别鉴定；用HiTrap rProtein A FF纯化柱纯化兔HBxAb多克隆抗体。结果：1SDS-PAGE证实本研究构建的2个表达系统均能高效表达目的蛋白；2.复性、纯化后野生型和双突变型GST-HBxAg浓度分别达到4.88mg/ml和5.07mg/ml;3.Western blot鉴定证实所纯化的野生型和双突变型HBxAg均能被同一种特异性的单克隆抗体所识别,提示2种重组抗原具有相似的抗原性；4.ELISA方法检测显示2种抗原都能成功包被于微量滴定板上并与乙肝患者血清反应；5.ELISA方法证实本研究制备的兔多克隆HBxAb-野生及HBxAb-突变均能特异地识别野生型和双突变型HBxAg。结论：本研究成功地构建了野生型和A1762T／G1764A双突变型HBV X基因表达系统,成功制备了兔抗HBxAg-野生及HBxAg-突变的多克隆抗体,为进一步研究A1762T／G1764A双突变对肿瘤发生学和慢性HBV感染者疾病进展的作用和分子机制奠定了基础。