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巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是广泛用于异源蛋白质生产的真核宿主菌。P.pastoris具有高效有氧呼吸模式、高级真核细胞的蛋白修饰能力、易于基因操作和较少的天然分泌蛋白等优势,但鲜有关于改造其底盘细胞GS115的报道。酵母细胞壁主要成分为β-葡聚糖和甘露聚糖,其较高的含量对自然环境中酵母的胁迫响应具有重要作用,而在工业发酵环境高含量的多聚糖极可能显得多余,并消耗大量碳源。近年来,底盘细胞设计成为优化菌株发酵性能的重要策略,其中简化细胞壁结构是手段之一,而目前没有针对P.pastoris细胞壁组分改造的报道。本研究首次探究降低细胞壁多聚糖含量对P.pastoris表达外源蛋白的影响,并通过表达人表皮生长因子(h EGF)和S-腺苷甲硫氨酸合酶2(SAM2)进行验证。由于细胞壁改造后可能因发酵过程中持续受到的氧化胁迫而加重脂质氧化,本研究对P.pastoris发酵过程的脂质过氧化情况和脂质分子变化进行了分析。主要研究内容和结论如下:(1)对P.pastoris GS115细胞壁β-1,3-葡聚糖、β-1,6葡聚糖和甘露聚糖相关编码基因进行敲除并验证。基于p Pp T4-p HTX1-hs Cas9质粒,分别对β-1,3-葡聚糖合酶的催化亚基基因(PAS_chr2-1_0661、PAS_chr2-1_0263),β-1,6葡聚糖生物合成所需的蛋白质的基因(PAS_chr4_0508、PAS_chr3_0929),以及α-1,2-甘露糖基转移酶相关基因(XP_002492593、PAS_chr1-3_0138、PAS_chr3_0882)基因敲除。共成功构建单基因缺失菌株5株和双基因缺失菌株1株。生长能力测试结果显示,GS115-?PAS_chr2-1_0661、GS115-?XP_002492593和GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661的生长情况优于GS115。其中,GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661最大OD600达到27.64,相比GS115提高了21.1%。GS115-?PAS_chr2-1_0661细胞壁中的β-葡聚糖含量相比GS115降低19.3%,GS115-?XP_002492593细胞壁的甘露聚糖含量降低14.3%,GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661细胞壁上的β-葡聚糖和甘露聚糖含量分别有5.5%和8.4%的降低。(2)对基因缺失菌株的碳源得率进行分析,并探究报告基因表达情况。结果显示,GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661的碳源得率最高,达到0.53 g?g-1。使用p GAPZ A-gfp表达绿色荧光蛋白,GS115-?PAS_chr2-1_0661和GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661表达的荧光相对强度比GS115分别提高16.6%和21.0%,表明XP_002492593和PAS_chr2-1_0661基因缺失的菌株具有高效表达外源蛋白的潜力。(3)以外源蛋白hEGF和SAM2为例,探究XP_002492593和PAS_chr2-1_0661缺失对外源蛋白表达产量的影响。构建组成型质粒p GAPZαA-hegf和p GAPZ A-sam2,在250 m L摇瓶水平GS115-?PAS_chr2-1_0661/p GAPZαA-hegf和GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661/p GAPZαA-hegf的胞外分泌h EGF最高达到了50.51 mg?L-1和53.12mg?L-1,相比GS115提高11.1%和16.8%;GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661/p GAPZ A-sam2表达的SAM2酶活达到515 U?m L-1,比GS115提高9.8%;在2L发酵罐体系培养84 h后,GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661/p GAPZ A-sam2的SAM产量比GS115提高19.7%,达到2.31 g?L-1。(4)进一步分析GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661与GS115在培养过程中的氧化胁迫差异。测定脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量变化,结果显示在稳定期和死亡期,MDA含量较高。GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661的MDA含量最高达到了0.41μmol?g-1干细胞,比GS115提高了15.8%。此外,为后续揭示发酵过程中细胞脂质变化,首次开展P.pastoris GS115全细胞脂质组的分析,为进一步改造底盘细胞奠定基础。本研究显示,P.pastoris GS115菌株XP_002492593和PAS_chr2-1_0661基因同时缺失后,不仅提高了细胞生长速率和碳源得率,还有利于外源基因hegf和sam2的表达,因此GS115-?XP_002492593-?PAS_chr2-1_0661是极具潜力的底盘细胞。