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背景及目的：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,简称Et）是肠杆菌科革兰氏阴性短杆菌，该菌感染宿主广泛，能够感染鱼类、两栖类、爬行类和人类等,引起鱼类爱德华氏菌病，造成水产养殖业重大的经济损失；它感染人体，引起败血症、肠炎、脑膜炎等。溶血相关基因（Et haemolysin activator gene，简称eha）是ET13菌中一个重要毒力转录调控因子，影响该菌的生物膜形成，但其机制不清楚。我们课题组前期通过免疫共沉淀（Chromatin coimmunoprecipitation, 简称ChIP）试验发现，eha可以和aroC直接结合。
生物膜内部的细菌能逃避免疫系统的攻击和抗菌药物的杀伤作用，使感染易于慢性化、难于控制。Et菌感染宿主时，一旦在其体内形成生物膜，将会使得抗生素等药物的药效降低，增强宿主的死亡率。aroC 基因编码的分支酸合成酶，是莽草酸代谢途径下游支点的重要酶,影响莽草酸途径次生代谢产物吲哚的产生；吲哚是细菌一种新的密度感应信号分子，在大肠杆菌中能影响该菌生物膜形成，因此,我们推测aroC能影响Et菌生物膜形成。
本文拟探讨：aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制，再进一步研究Eha调控aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制。
方法：
1. aroC缺失株与互补株构建
1) 利用自杀质粒pWM91构建ET13菌的aroC缺失株（△aroC）。首先将合成的aroC 两侧片段F1F2与自杀质粒pWM91连接，连接产物涂布在LB平板（含Ampr），PCR和双酶切鉴定重组质粒pWM91-F1F2；再将该重组质粒电转入E.Coli SM10λpir中，含重组质粒的SM10λpir与ET13菌进行接合反应，接合产物涂布在平板上（含Ampr和colr），挑选阳性菌落，并用PCR鉴定筛选接合子；再将接合子涂布在含15%蔗糖的LB平板（含Colr），挑选在Ampr和colr双抗平板上不生长，仅在colr抗性平板上生长的菌落，并用PCR筛选△aroC株；传代十次以后，用PCR挑选稳定的△aroC株。
2) 将aroC片段与质粒pACYC184连接，构建重组质粒pACYC184-aroC，将其电转入△aroC株，挑选LB平板（含Tetr）上的单菌落，并用PCR和双酶切鉴定C△aroC株。
2. aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制研究
1）首先，用试管-结晶紫法检测野生株、△aroC株及C△aroC株在8、12、16、24、36、48、60及72h不同时间体外生物膜形成的情况，进一步利用96孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法比较上述三种菌株在48h时体外生物膜形成的差异。
2） 建立小鼠皮下植入物细菌生物膜形成模型，摸索不同ET13菌液浓度及培养时间对皮下植入物表面生物膜形成的影响，利用荧光染色法与扫描电镜法比较小鼠皮下植入物表面野生株和△aroC株在72h时形成生物膜的差异，并对植入物表面生物膜内的野生株和△aroC株细菌数目进行了平板计数。
3） 利用软琼脂平板法、穿透黏蛋白法、镀银法及qRT-PCR法分别检测上述菌株运动、鞭毛形态和合成相关基因转录水平；利用Hep-2细胞粘附试验及肠定植试验检测野生株与△aroC 株粘附能力，并利用蛋白定量法、苯酚-硫酸法及香醛法分别检测胞外多聚物中蛋白质、多糖和脂质的含量；最后，利用对二甲氨基苯甲醛法测定上述菌株培养基上清中吲哚浓度，并利用荧光染色法检测外源性吲哚对△aroC株生物膜形成的影响。
3. Eha调控aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制
1） 将aroC启动子区域片段插在质粒pBAD-lacZ报告基因lacZ前，构pBAD-ParoC-LacZ质粒，并将该质粒分别电击进入 ET13 的野生株和△eha 株，构建了pBAD-ParoC-lacZ-ET13和pBAD-ParoClacZ-△eha两种菌株。利用qRT-PCR法检测野生株与△eha株中 aroC基因的转录活性，ELISA法比较上述两种菌株在0.5%H2O和pH=6.3条件下所产生的β-gal活性的差异。
2） 将重组质粒pACYC184-aroC电转入△eha株中，构建△eha-aroC不完全互补株。
3） 利用 96 孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法分别比较野生株、△eha 株、C△eha 株和△eha-aroC 株在体外 48h 时形成的生物膜；软琼脂平板法、镀银法及qRT-PCR法分别检测上述菌株运动、鞭毛形态和合成相关基因转录水平，并利用蛋白定量法、苯酚-硫酸法及香醛法分别检测上述菌株胞外多聚物中蛋白质、多糖和脂质的含量；最后，利用对二甲氨基苯甲醛法测定上述菌株培养基上清中吲哚浓度。
结果：
1. aroC缺失株与互补株构建
1) △aroC株的PCR鉴定结果显示，ET13菌株中aroC基因成功敲除。
2) C△aroC株的PCR鉴定与pACYC184-aroC重组质粒测序结果显示，△aroC株中含有该重组质粒。
2. aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制研究
1）试管-结晶紫法检测结果显示：野生株与C△aroC株在48h时形成成熟地生物膜，而△aroC株形成的生物膜极少。96孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法结果显示，野生株与C△aroC株在盖玻片表面形成的生物膜量多且聚集分布，而△aroC株在盖破片表面形成的生物膜极少且零散分布。
2） 10μL含菌量1×108的△aroC株在小鼠皮下植入物表面培养72h时形成的生物膜量明显少于野生株。
3） 野生株和互补株运动环直径长于△aroC株，形成的鞭毛数量多且长；△aroC株鞭毛短且数目少、该缺失株中鞭毛合成基因fliA转录水平显著下降。
4） 光镜下观察这些菌株粘附Hep-2细胞的数目并将粘附细胞的细菌进行菌落计数，结果发现，△aroC株粘附在Hep-2细胞上的数目明显少于野生株；小鼠肠定植结果显示，△aroC株仅在第3天与第5天定植在小肠的细菌数少于野生株。
5） 与野生株和互补株相比，该△aroC株生长4h后，产生的吲哚浓度显著下降，添加不同浓度外源性吲哚至缺失株LB培养基中，缺失株形成的生物膜量逐渐增多，特别是添加30μM吲哚，该缺失株的生物膜增加量最明显。
3. Eha调控aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制研究
1） PCR 鉴定电泳结果与重组质粒测序结果显示，成功地构建了 pBAD-ParoClacZ-ET13和pBAD-ParoClacZ-△eha两种菌株。
2）与野生株和C△eha相比，△eha株中aroC基因转录水平明显下降，野生株和C△eha中该基因的转录水平无明显差异；ELISA法结果显示：在0.5%H2O2和pH=6.3条件下 ， pBAD-lacZ-ParoC-ET13 株 所 产 生 β- 半 乳 糖 苷 酶 活 性 明 显 高 于pBAD-lacZ-ParoC-△eha株。
3） 96孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法检测结果显示：野生株和C△eha株在48h时形成的生物膜量多于△eha株和△eha-aroC株，且△eha-aroC株形成的生物膜量多于△eha株；△eha株在48h时形成的生物膜量明显少于野生株和C△eha株且生物膜分布零散。
4）软琼脂平板法检测结果显示，△eha株和△eha-aroC株的运动环直径明显短于野生株和C△eha株，△eha株和△eha-aroC株的运动环直径无明显差异；镀银法与qRT-PCR的结果发现，与野生株和C△eha株相比，△eha株和△eha-aroC株鞭毛变短且数目减少、鞭毛合成相关基因fliA转录水平显著下降；与△eha株相比，△eha-aroC株鞭毛长且数量多、fliA基因转录水平高。
5） 利用蛋白定量法、苯酚-硫酸法及香醛法检测结果显示，与野生株和C△eha株相比，△eha株和△eha-aroC株生物膜胞外多聚物中仅多糖含量明显下降，而且△eha-aroC株胞外多聚物中多糖含量高于△eha株。对二甲氨基苯甲醛法检测结果显示，△eha株和△eha-aroC株分泌到培养基上清的吲哚浓度明显低于野生株和C△eha株，而且△eha-aroC株分泌到培养基上清的吲哚浓度高于△eha株。
结论：
1. aroC基因缺失，ET13菌体内外生物膜形成能力降低；
2. aroC基因通过影响ET13菌鞭毛合成、上皮细胞粘附、胞外多聚物中多糖及QS信号分子吲哚的生成，来减少该菌生物膜的形成；
3. 转录调控因子Eha对aroC基因的表达起正调控作用；
4. eha基因通过影响ET13菌鞭毛合成、上皮细胞粘附、胞外多聚物中多糖及QS信号分子吲哚的生成，来减少该菌生物膜的形成；该缺失株中过表达aroC基因，能回复部分上述功能。
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,简称Et）是肠杆菌科革兰氏阴性短杆菌，该菌感染宿主广泛，能够感染鱼类、两栖类、爬行类和人类等,引起鱼类爱德华氏菌病，造成水产养殖业重大的经济损失；它感染人体，引起败血症、肠炎、脑膜炎等。溶血相关基因（Et haemolysin activator gene，简称eha）是ET13菌中一个重要毒力转录调控因子，影响该菌的生物膜形成，但其机制不清楚。我们课题组前期通过免疫共沉淀（Chromatin coimmunoprecipitation, 简称ChIP）试验发现，eha可以和aroC直接结合。
生物膜内部的细菌能逃避免疫系统的攻击和抗菌药物的杀伤作用，使感染易于慢性化、难于控制。Et菌感染宿主时，一旦在其体内形成生物膜，将会使得抗生素等药物的药效降低，增强宿主的死亡率。aroC 基因编码的分支酸合成酶，是莽草酸代谢途径下游支点的重要酶,影响莽草酸途径次生代谢产物吲哚的产生；吲哚是细菌一种新的密度感应信号分子，在大肠杆菌中能影响该菌生物膜形成，因此,我们推测aroC能影响Et菌生物膜形成。
本文拟探讨：aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制，再进一步研究Eha调控aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制。
方法：
1. aroC缺失株与互补株构建
1) 利用自杀质粒pWM91构建ET13菌的aroC缺失株（△aroC）。首先将合成的aroC 两侧片段F1F2与自杀质粒pWM91连接，连接产物涂布在LB平板（含Ampr），PCR和双酶切鉴定重组质粒pWM91-F1F2；再将该重组质粒电转入E.Coli SM10λpir中，含重组质粒的SM10λpir与ET13菌进行接合反应，接合产物涂布在平板上（含Ampr和colr），挑选阳性菌落，并用PCR鉴定筛选接合子；再将接合子涂布在含15%蔗糖的LB平板（含Colr），挑选在Ampr和colr双抗平板上不生长，仅在colr抗性平板上生长的菌落，并用PCR筛选△aroC株；传代十次以后，用PCR挑选稳定的△aroC株。
2) 将aroC片段与质粒pACYC184连接，构建重组质粒pACYC184-aroC，将其电转入△aroC株，挑选LB平板（含Tetr）上的单菌落，并用PCR和双酶切鉴定C△aroC株。
2. aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制研究
1）首先，用试管-结晶紫法检测野生株、△aroC株及C△aroC株在8、12、16、24、36、48、60及72h不同时间体外生物膜形成的情况，进一步利用96孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法比较上述三种菌株在48h时体外生物膜形成的差异。
2） 建立小鼠皮下植入物细菌生物膜形成模型，摸索不同ET13菌液浓度及培养时间对皮下植入物表面生物膜形成的影响，利用荧光染色法与扫描电镜法比较小鼠皮下植入物表面野生株和△aroC株在72h时形成生物膜的差异，并对植入物表面生物膜内的野生株和△aroC株细菌数目进行了平板计数。
3） 利用软琼脂平板法、穿透黏蛋白法、镀银法及qRT-PCR法分别检测上述菌株运动、鞭毛形态和合成相关基因转录水平；利用Hep-2细胞粘附试验及肠定植试验检测野生株与△aroC 株粘附能力，并利用蛋白定量法、苯酚-硫酸法及香醛法分别检测胞外多聚物中蛋白质、多糖和脂质的含量；最后，利用对二甲氨基苯甲醛法测定上述菌株培养基上清中吲哚浓度，并利用荧光染色法检测外源性吲哚对△aroC株生物膜形成的影响。
3. Eha调控aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制
1） 将aroC启动子区域片段插在质粒pBAD-lacZ报告基因lacZ前，构pBAD-ParoC-LacZ质粒，并将该质粒分别电击进入 ET13 的野生株和△eha 株，构建了pBAD-ParoC-lacZ-ET13和pBAD-ParoClacZ-△eha两种菌株。利用qRT-PCR法检测野生株与△eha株中 aroC基因的转录活性，ELISA法比较上述两种菌株在0.5%H2O和pH=6.3条件下所产生的β-gal活性的差异。
2） 将重组质粒pACYC184-aroC电转入△eha株中，构建△eha-aroC不完全互补株。
3） 利用 96 孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法分别比较野生株、△eha 株、C△eha 株和△eha-aroC 株在体外 48h 时形成的生物膜；软琼脂平板法、镀银法及qRT-PCR法分别检测上述菌株运动、鞭毛形态和合成相关基因转录水平，并利用蛋白定量法、苯酚-硫酸法及香醛法分别检测上述菌株胞外多聚物中蛋白质、多糖和脂质的含量；最后，利用对二甲氨基苯甲醛法测定上述菌株培养基上清中吲哚浓度。
结果：
1. aroC缺失株与互补株构建
1) △aroC株的PCR鉴定结果显示，ET13菌株中aroC基因成功敲除。
2) C△aroC株的PCR鉴定与pACYC184-aroC重组质粒测序结果显示，△aroC株中含有该重组质粒。
2. aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制研究
1）试管-结晶紫法检测结果显示：野生株与C△aroC株在48h时形成成熟地生物膜，而△aroC株形成的生物膜极少。96孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法结果显示，野生株与C△aroC株在盖玻片表面形成的生物膜量多且聚集分布，而△aroC株在盖破片表面形成的生物膜极少且零散分布。
2） 10μL含菌量1×108的△aroC株在小鼠皮下植入物表面培养72h时形成的生物膜量明显少于野生株。
3） 野生株和互补株运动环直径长于△aroC株，形成的鞭毛数量多且长；△aroC株鞭毛短且数目少、该缺失株中鞭毛合成基因fliA转录水平显著下降。
4） 光镜下观察这些菌株粘附Hep-2细胞的数目并将粘附细胞的细菌进行菌落计数，结果发现，△aroC株粘附在Hep-2细胞上的数目明显少于野生株；小鼠肠定植结果显示，△aroC株仅在第3天与第5天定植在小肠的细菌数少于野生株。
5） 与野生株和互补株相比，该△aroC株生长4h后，产生的吲哚浓度显著下降，添加不同浓度外源性吲哚至缺失株LB培养基中，缺失株形成的生物膜量逐渐增多，特别是添加30μM吲哚，该缺失株的生物膜增加量最明显。
3. Eha调控aroC对ET13菌生物膜形成的影响及其机制研究
1） PCR 鉴定电泳结果与重组质粒测序结果显示，成功地构建了 pBAD-ParoClacZ-ET13和pBAD-ParoClacZ-△eha两种菌株。
2）与野生株和C△eha相比，△eha株中aroC基因转录水平明显下降，野生株和C△eha中该基因的转录水平无明显差异；ELISA法结果显示：在0.5%H2O2和pH=6.3条件下 ， pBAD-lacZ-ParoC-ET13 株 所 产 生 β- 半 乳 糖 苷 酶 活 性 明 显 高 于pBAD-lacZ-ParoC-△eha株。
3） 96孔酶标板结晶紫法、荧光染色法及扫描电镜法检测结果显示：野生株和C△eha株在48h时形成的生物膜量多于△eha株和△eha-aroC株，且△eha-aroC株形成的生物膜量多于△eha株；△eha株在48h时形成的生物膜量明显少于野生株和C△eha株且生物膜分布零散。
4）软琼脂平板法检测结果显示，△eha株和△eha-aroC株的运动环直径明显短于野生株和C△eha株，△eha株和△eha-aroC株的运动环直径无明显差异；镀银法与qRT-PCR的结果发现，与野生株和C△eha株相比，△eha株和△eha-aroC株鞭毛变短且数目减少、鞭毛合成相关基因fliA转录水平显著下降；与△eha株相比，△eha-aroC株鞭毛长且数量多、fliA基因转录水平高。
5） 利用蛋白定量法、苯酚-硫酸法及香醛法检测结果显示，与野生株和C△eha株相比，△eha株和△eha-aroC株生物膜胞外多聚物中仅多糖含量明显下降，而且△eha-aroC株胞外多聚物中多糖含量高于△eha株。对二甲氨基苯甲醛法检测结果显示，△eha株和△eha-aroC株分泌到培养基上清的吲哚浓度明显低于野生株和C△eha株，而且△eha-aroC株分泌到培养基上清的吲哚浓度高于△eha株。
结论：
1. aroC基因缺失，ET13菌体内外生物膜形成能力降低；
2. aroC基因通过影响ET13菌鞭毛合成、上皮细胞粘附、胞外多聚物中多糖及QS信号分子吲哚的生成，来减少该菌生物膜的形成；
3. 转录调控因子Eha对aroC基因的表达起正调控作用；
4. eha基因通过影响ET13菌鞭毛合成、上皮细胞粘附、胞外多聚物中多糖及QS信号分子吲哚的生成，来减少该菌生物膜的形成；该缺失株中过表达aroC基因，能回复部分上述功能。