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背景：
目前，脑血管病的发病率和病死率不断升高，尤其成为了威胁人类身体健康的突出问题和医学研究的热点问题。新的治疗药物和物理治疗方法的临床应用，不断地改善着急诊的抢救成功率和延长了病人的生命，但是依然不能从根本上逆转病人病理生理变化，受损的脑机能难以恢复。本课题根据近年来脑血管病后组织修复的细胞学和分子生物学研究进展，设计了HRE(低氧反应元件)调控的分泌表达“血管生成的总开关”-PR39与人硫氧还蛋白hTRX融合表达的重组腺相关病毒，通过介入方式转导有脑供血不足和具有梗塞性脑血管病倾向的脑组织和血管。目的是希望在脑缺氧和梗塞发生早期能起动PR39的分泌表达，通过它特异的抑制泛素-蛋白酶体对HIF-1α的降解，来增加血管形成的细胞因子和受体(VEGFA、KDR、FLT-1和FGF-1)长期持续性高表达，实现脑缺氧和梗塞发生后的早期神经元修复和血管再建，也通过PR39具有的抗炎症反应、抗缺血缺氧应激凋亡作用，人硫氧还蛋白的抗氧化、抗细胞凋亡、保护缺血再灌注损伤及神经因子样作用等，保护受损害神经细胞的存活和功能。它将为缺血性脑血管病的预防和治疗寻找新的理论和方法。
目的：
为了探讨PR39对脑缺血的保护作用，本研究构建腺相关病毒(AAV)介导的融和基因hTRX-PR39，验证其在人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞株)表达；在缺氧ECV304细胞内提高VEGF-A，VEGFR-1，VEGFR-2，FGFR-1，Syndecan-4表达水平及抗缺氧应激凋亡作用及其对缺氧环境鸡胚的促血管生成作用。
方法：
1.设计合成PR39的正向和反向引物，使用互为引物模板PCR方法，扩增获得两端具有BamHI和Ecor721酶切位点的PR39cDNA片段。将该片段克隆到pGEM-Teasy中，转化细菌筛选阳性克隆，酶切鉴定，序列测定分析。
2.以已有hTRX片段为模板，设计合成hTRX的正向和反向引物，PCR扩增获得具有Eco721和EcoI酶切位点的hTRX cDNA片段。并将其克隆到pGEM-T easy中，转化细菌筛选阳性克隆，酶切鉴定，序列测定分析。
3.BamHI和EcoR721双酶切pGEM-T-hTRX和pGEM-T-PR39，将获取的PR39/BamHI，EcoRI721片段克隆到pGEM-T-hTRX/BamHI，EcoRI721载体中，构建了pGEM-T-hTRX-PR39载体。
4.酶切上述载体获取hTRX-PR39融合基因，将其插入具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中，得到重组腺相关病毒载体质粒。
5.将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系，通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体，收集病毒，斑点杂交(Dot blot)法测定病毒滴度。
6.AAV-hTRX-PR39和空病毒载体(EV)分别感染ECV304，免疫细胞化学检测hTRX表达情况，以此验证融合基因在的ECV304表达。
7.将ECV304分为AAV-hTRX-PR39组和PBS组，在1％、5％O2条件下培养，应用台盼蓝染色法进行活细胞计数，观察hTRX-PR39对缺氧细胞的保护作用。
8.流式细胞仪检测(FCM)分析低氧环境下ECV304细胞凋亡情况。
9.应用定量PCR检测仪检测ECV304中VEGF-A，VEGFR-1，VEGFR-2，FGFR-1，Syndecan-4及PR39的表达水平。
10.120只鸡胚随机分为AAV-hTRX-PR39组和PBS组，将各组细胞分别在低氧(1％O2、5％O2)和常氧(20％O2)条件培养，图象软件Image Pro Plus(IPP)分析鸡胚尿膜囊(CAM)血管密度。
结果：
1.经DNA测序证实，PCR获得了编码具有Eco721和EcoI酶切位点的hTRX cDNA片段和编码BamHI和EcoR721酶切位点的PR39cDNA片段。分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。
2.hTRX-PP39融合基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确，测序结果与实验设计的序列完全一致。
3.重组质粒pGEM-T-hTRX-PR39酶切图谱证实我们已经将hTRX-PR39融合肽cDNA克隆到pGEM-T表达载体中。
4.成功构建了重组腺相关病毒质粒pSSCMV/hTRX-PR39。包装、回收病毒后，Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×1012～3.46×1013PFU/ml。
5.免疫细胞化学检测到重组hTRX-PR39的AAV载体能在ECV304中进行表达。
6.定量PCR检测到重组AAV-hTRX-PR39可提高缺氧ECV304中VEGF-A，VEGFR-1，VEGFR-2，FGFR-1，Syndecan-4及PR39的表达水平，明显高于PBS组(P＜0.001)。
7.流式细胞仪分析低氧环境下ECV304细胞周期图，实验组ECV304中凋亡率明显小于PBS组。
8.低氧环境下，实验组的鸡胚尿膜囊血管密度明显大于PBS组。在常氧环境下，血管密度并无明显差别。
结论：
1.应用PCR成功克隆出具有EcoR721和EcoRI酶切位点的hTRX cDNA片段。
2.应用PCR成功克隆出具有BaEH I和EcoR721酶切位点的PR39cDNA片段。
3.成功构建了pGEM-T-hTRX-PR39载体。
4.成功构建了pSSCMV/hTRX-PR39重组腺相关病毒载体，并成功包装了较高浓麾的重组病毒。
5.hTRX-PR39具有抗缺氧应激细胞凋亡作用。
6.重组AAV-hTRX-PR39载体对缺氧鸡胚血管生成具有显著的促进作用。