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磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一,在植物的生长发育过程中起着重要作用.关于植物适应低磷胁迫的分子遗传生理生化机制已有一些报道,但是人们对于这方面的了解还很有限,尚待更深入的研究.该项研究工作以该实验室筛选的拟南芥隐性单基因耐低磷突变体lpt3为研究对象,通过图位法克隆目的基因,并对其在磷代谢中的调节作用进行了初步研究.利用拟南芥数据库提供的拟南芥遗传图谱上已知的分子标记以及根据SNP数据库的信息新设计的SSLP及CAPS分子标记,将突变基因定位在BAC克隆MJB21的40.8kb的区域内,然后通过对定位区间内的基因进行测序,确定在lpt3突变体中基因at5g42800发生了单碱基突变.该基因编码二氢黄酮醇还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR),共有6个外显子,突变位点位于第3个外显子上.ORF的第511位碱基(即组DNA的第760位碱基)所发生的由G到A的置换导致基因所编码的第171位氨基酸由酸性的谷氨酸突变为碱性的赖氨酸.lpt3与DFR敲除突变体(X-射线诱变)cs84的杂交实验结果表明杂交后代与突变体的性状表现一致,在低磷培养基上均表现生长点不变紫.对lpt3突变体和野生型的表型观察分析表明,在低磷条件下,lpt3的生物量明显高于野生型;磷的耗竭实验分析结果表明突变体在低磷条件下对磷的吸收速率快于野生型,说明DFR基因可能对磷的吸收具有调控作用.突变体lpt3的3-4天幼苗在低磷培养基上与对照相比无明显生长优势;10天的幼苗移至低磷培养基上,15天后能正常抽薹开花,而野生型不能抽薹开花,说明DFR的调控作用具有时间性.RNA杂交结果表明,7-8天的拟南芥幼苗在MS条件下DFR的表达水平较低,在受到低磷诱导6小时后,DFR的表达量明显提高,说明DFR对低磷信号的响应比较迅速.低磷诱导18小时DFR的表达量达到最高,然后又下降,说明DFR对低磷的响应存在着节律性.在正常及低磷诱导条件下lpt3中DFR的转录水平均高于野生型,其意义何在有待于进一步研究.GUS染色结果表明6天龄拟南芥幼苗的地上和地下部分均有GUS活性,说明DFR基因是组成型表达的,可能与大多数类型细胞的代谢活动相关;维管组织中的GUS活性较高,推测DFR除了在花青素的合成途径中起关键作用外,可能对植物体内的物质运输以及通过物质运输而进行的信号传递起调控作用.综合论文试验结果认为,拟南芥lpt3突变体中DFR基因一个碱基的突变导致了DFR基因的表达水平提高,同时可能导致突变体耐低磷能力的提高.DFR可能对磷的吸收或信号转导过程有调控作用.