良性气道狭窄是指气管支气管结核、外伤、手术、气管切开、气管插管、异物、良性肿瘤、淀粉样变等引起的气道占位性或瘢痕挛缩性狭窄,以及复发性多软骨炎和甲状腺囊肿对气道壁的破坏引起的气道塌陷性狭窄。近年来随着抢救和呼吸支持等抢救技术水平的提高,以及肺移植、气道手术的开展和普及,气道狭窄的发生率逐渐增高,而由复发性多软骨炎和甲状腺囊肿对气道壁的破坏引起的气道塌陷性狭窄较少见。其中引起气管瘢痕性狭窄的常见原因之一是气道创伤。气道狭窄已成为呼吸系统的一种常见疾病,其中良性气道狭窄也成为呼吸介入领域的常见疾病。目前因气道狭窄机制仍不明确,支气管镜介入治疗及外科手术切除瘢痕组织是治疗良性气道狭窄的主要方法,但手术切除瘢痕组织后患者仍有较高的再狭窄发生率。最近研究发现,气管粘膜的损伤破坏了局部粘膜血液循环,从而导致粘膜缺血和低氧产生,随后形成粘膜糜烂、溃疡和气管软骨炎。Karine Deschene研究表明,由于粘膜损伤所致的低灌注状态改变了创伤部位的温度、p H值和气体交换,从而在创伤部位形成气道内低氧环境。这种微环境的改变更有利于成纤维细胞的激活。体外细胞培养、动物实验和临床患者的研究均表明低氧是导致炎症发生、瘢痕形成和纤维化的重要因素。气管软骨化导致气道狭窄是由于病变长期压迫气管软骨,使局部供血不足或局部缺血,引起软骨环变细、变薄,弹性减弱,晚期可造成软骨环吸收、消失,呈膜性组织。低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是组织在缺氧环境下介导适应性反应的关键核转录因子,是哺乳动物和人体细胞内存在的一类氧依赖性保护性核转录因子,在低氧条件下可与靶基因的缺氧应答原件结合,从而激活靶基因的转录。HIF-1由α、β两个亚基组成,其活性主要由α亚基决定。HIF-1α既是HIF-1的调节亚基又是活性亚基,其蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节。受HIF-1调控的基因包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)、组织基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factors,b FGF)等。这些靶基因与血管新生、糖代谢、细胞生存及凋亡等有关。国内外最初关于HIF-1α的大量研究集中在其对实体肿瘤的增长及转移作用方面,认为HIF-1α信号通路在维持肿瘤干细胞特征和转移发生中起举足轻重的作用,可促进肿瘤的发生和发展。同时有研究表明HIF-1α抑制剂可能成为非常有前景的抗实体肿瘤靶向治疗药物。近年来,瘢痕疙瘩中的低氧环境及HIF-1α在瘢痕形成及收缩过程中的作用受到越来越广泛的关注。气道狭窄瘢痕本质上是纤维增殖性疾病,以胶原为主的细胞外基质过度表达和成分改变是气道狭窄瘢痕的病理特征。郑旭东等报道,瘢痕疙瘩中成纤维细胞在缺氧状态下HIF-1α蛋白表达上调,HIF-1α调控的缺氧通路可以提高成纤维细胞活性并参与瘢痕形成。Daniele M等进行的体外研究发现,低氧环境下HIF-1α可以促进成纤维细胞分泌细胞外基质,胶原合成增加。Zhang等的研究也证实了上述发现并且提出瘢痕疙瘩中HIF-1α表达的增加与ERK1/2和Akt通路激活有关。Vincent等研究发现人类皮肤瘢痕疙瘩中成纤维细胞的生物学特性与肿瘤细胞相似,并且认为瘢痕疙瘩对放疗的不敏感与病变组织内HIF-1α的高表达有密切关系。Robert M等研究表明心肌纤维细胞在低氧环境下可以向肌成纤维细胞转化。此外,HIF-lα也可以通过增加细胞外基质的合成,减少细胞外基质降解,参与肾间质纤维化的发生。而HIF-lα是否参与良性气道狭窄疾病的瘢痕组织形成及其相关信号转导通路目前尚无报道。本研究旨在探讨HIF-1α在良性气道狭窄患者瘢痕形成中的作用及机制。前两部分研究在组织学水平探讨HIF-1α及其下游靶基因在良性气道狭窄患者瘢痕中的表达,以及瘢痕形成过程中成纤维细胞的活化。后两部分通过对成纤维细胞的鉴定以及在体外低氧培养建立成纤维细胞缺氧模型,在细胞水平进一步验证HIF-1α对成纤维细胞的活化作用及其下游信号分子参与瘢痕形成的机制。论文具体内容如下:第一部分低氧诱导因子HIF-1α在良性气道狭窄患者瘢痕中的表达目的:探讨低氧诱导因子-1α在良性气道狭窄患者瘢痕中的表达。方法:根据电子支气管镜下检查结果,将患者分为三组(8人/组),即肉芽肿组(granulation phase group,GRA)、增生组(proliferative phase group,PRO)、瘢痕组(mature phase group,MAT)。采用Real-time PCR和westernblot方法检测三组良性气道狭窄患者肉芽组织HIF-1α的表达量。结果:HIF-1αm RNA水平在肉芽期最高,与增殖期、瘢痕期相比有统计学差异(p<0.01),增殖期HIF-1αm RNA水平高于瘢痕期,且亦有统计学差异(p<0.01)。三组间HIF-1α蛋白表达量也不同,肉芽期HIF-1α蛋白表达最多(p<0.05),然后逐渐下降,瘢痕期蛋白表达最低,与其它两组相比p<0.01,差异有统计学意义。结论:气道狭窄瘢痕形成初期即肉芽肿期HIF-1α表达最多,之后呈逐渐下降趋势,在成熟期HIF-1α的表达最低,提示HIF-1α与气道狭窄形成有关。第二部分低氧诱导因子HIF-1α介导气道狭窄患者瘢痕组织形成的目的:探讨低氧诱导因子-1α介导良性气道狭窄患者瘢痕组织形成的机制。方法:根据电子支气管镜下检查结果,将患者分为三组(8人/组),即肉芽肿组、增生组、瘢痕组。用western blot方法检测良性气道狭窄患者气道病变组织的α-SMA、Caspase 3、Ⅰ型/Ⅲ型胶原、VEGF、b FGF、TGF-β蛋白的表达。结果:1与肉芽肿期及成熟期比较,α-SMA的表达量在增殖期最高(p<0.05),成熟期表达最低,且成熟期与肉芽肿期相比明显下降(p<0.05),差异有统计学意义。2不同阶段Ⅰ型、Ⅲ型胶原以及TGF-β的蛋白表达与α-SMA呈相同的变化趋势,且Ⅰ型与Ⅲ型胶原的比值呈现相同的趋势。3 VEGF蛋白表达呈逐渐下降趋势,肉芽肿期表达最多,明显高于增殖期及成熟期(p<0.05),成熟期表达最少,与增殖期相比明显下降(p<0.05),差异均有统计学意义。4不同阶段b FGF与Caspase-3的蛋白表达与VEGF呈相同的变化趋势。结论:1Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白量及二者比值在肉芽期及增殖期明显增加,成熟期下降,提示肌成纤维细胞的增殖及分泌功能活跃在气道狭窄形成中有重要作用。2 VEGF蛋白表达在肉芽肿期及增殖期均明显增加,肉芽肿期最多,然后逐渐下降,成熟期最低,提示VEGF在气管创伤愈合及瘢痕形成中发挥重要作用。3肉芽肿期b FGF表达最多,成熟期明显下降,提示b FGF参与了良性气道狭窄的形成,这与其刺激血管形成有密切关系。4 Caspase-3在瘢痕期的表达明显低于肉芽肿期及增殖期,提示气管瘢痕形成不同时期成纤维细胞凋亡逐渐受抑制,而增殖性大大增加,故在临床上表现为浸润性生长,及易复发性。第三部分良性气道狭窄患者瘢痕组织中成纤维细胞分离和鉴定目的:体外进行良性气道狭窄患者瘢痕组织中成纤维细胞的分离、纯化和鉴定,以进行细胞水平的研究。方法:用组织块培养方法对良性气道狭窄患者的瘢痕组织进行原代培养,分离成纤维细胞,在倒置显微镜下进行形态观察,用HE染色及免疫组化方法进行鉴定。结果:1倒置显微镜下观察贴壁细胞为典型的长梭形,其胞体较大,细胞界限清楚,立体感强,折光性高。2免疫组化结果显示细胞波形蛋白染色呈阳性,胞浆内见大量棕黄色颗粒。3 HE染色显示细胞呈长梭形,轮廓清楚,核仁大而明显。结论:用改良组织块培养方法培养出的细胞经形态观察及免疫组织化学和HE染色,鉴定为成纤维细胞。第四部分低氧环境下HIF-1α对成纤维细胞活化及凋亡的调控及其目的:探讨HIF-1α对成纤维细胞活化和凋亡的调控及其机制。方法:1体外分离培养气道狭窄局部成纤维细胞,采用三气培养体系建立低氧-成纤维细胞体外细胞培养模型。选用第3~4代气道肉芽组织成纤维细胞随机分为四组,将其置于4%低氧浓度的培养箱内分别培养12 h、24 h、48 h及72 h,用Real-time PCR和western blot方法检测HIF-1α、α-SMA、b FGF、VEGF及TGF-βm RNA和蛋白的表达。2选用第3~4代肉芽组织成纤维细胞随机分为四组,分别置于含4%、8%、16%低氧及正常氧浓度的培养箱内培养12 h,用Real-time PCR和western blot方法检测HIF-1α、α-SMA、b FGF、VEGF及TGF-βm RNA和蛋白的表达。结果:1 4%低氧浓度培养条件下,随着时间的延长,HIF-1αm RNA及蛋白表达水平逐渐升高(p<0.05),其靶基因α-SMA、VEGF、b FGF及TGF-β的m RNA及蛋白表达水平在低氧环境下培养不同时间后,相对于对照组而言,均有不同程度的增高。2在16%,8%,4%不同低氧浓度下培养相同时间,HIF-1αm RNA及蛋白表达水平随着氧浓度的逐渐降低而升高(p<0.05)。其靶基因α-SMA、VEGF、b FGF及TGF-β的m RNA及蛋白表达水平在不同低氧浓度下相对于正常氧浓度组而言,均有不同程度的增高。结论:低氧环境刺激成纤维细胞不同时间或逐渐降低氧浓度但培养相同时间均可以促进HIF-1α及其靶基因α-SMA、b FGF、VEGF及TGF-βm RNA和蛋白的表达。提示HIF-1α可以通过活化成纤维细胞,促进与新血管生成及细胞增殖有关基因的表达来参与良性气道狭窄患者瘢痕的形成。