研究背景及目的肺癌是全世界发病率最高也是死亡率最高的癌症。肺癌大致可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类,其中NSCLC约占80%~85%。尽管得益于手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等方面的不断突破,NSCLC的早期诊断和治疗均取得一定成果,但总体的生存率、尤其是晚期NSCLC患者的生存率仍面临极大挑战。因此,进一步深入的阐明肺癌的发病机制,探索新的治疗靶点仍十分迫切。研究表明,免疫逃逸是肿瘤发生、发展的重要机制,并可大致分为两个方面,源于肿瘤细胞自身的逃逸机制和源于肿瘤微环境中免疫细胞的逃逸机制。PD-1/PD-L1信号通路的激活是肿瘤免疫逃逸的重要机制。T细胞表面的PD-1(程序性死亡受体-1,Programmed cell death-1)与肿瘤细胞表面的PD-L1(程序性死亡配体1,Programmed death-ligand 1)结合后可使下游TCR信号通路的多个关键分子发生去磷酸化,从而传递抑制性信号,阻碍T细胞的增殖和活化、促进肿瘤细胞的免疫逃逸。目前,基于阻断PD-1/PD-L1信号通路的免疫检查点疗法在癌症治疗中取得了一定的疗效。然而,大量临床试验结果显示,使用PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗的客观应答率仍然较低。因此进一步深入探讨NSCLC细胞PD-L1的表达调控机制有利于进一步阻断PD-1/PD-L1信号通路的活化,改善免疫治疗效果。PD-L1的表达调控主要存在―内源性‖和―外源性‖两大通路。其中,原癌基因突变或缺失导致的PD-L1表达持续上调是―内源性‖调控的主要机理。另一方面,肿瘤细胞所处的特定微环境是PD-L1高表达的―外源性‖促进机制。比如在低氧环境中,上调的低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)可通过结合PD-L1启动子的低氧反应元件促进PD-L1的表达。但目前,NSCLC中PD-L1的表达增多的内在分子机制尚不完全清楚,因此深入阐明NSCLC细胞PD-L1基础表达水平过高的分子机制,有望从―源头‖上抑制PD-L1的表达。Zeste增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一种重要的表观遗传学调控分子,具有组蛋白甲基转移酶活性,可催化组蛋白H3第27位的赖氨酸三甲基化,从而介导基因沉默。EZH2在多种肿瘤组织中过度表达,且其抑制剂在早期临床试验中取得了较好的疗效,表明该蛋白是一种潜在的治疗靶点。目前,EZH2参与NSCLC发生发展的机制尚不完全清楚。EZH2的下游信号通路十分广泛,并可抑制T辅助因子1(Th1)型趋化因子CXCL9和CXCL10的产生,从而在人类卵巢癌中建立免疫抑制微环境。因此,有必要研究EZH2是否参与NSCLC的免疫抑制,且该过程是否与NSCLC细胞PD-L1的表达存在关联。综上所述,本课题拟通过下载TCGA数据库中肺癌的基因芯片数据并收集NSCLC患者组织样本,检测并分析EZH2在NSCLC组织中的表达情况及其与PD-L1表达和患者预后的相关性。结合体内和体外实验抑制EZH2以探究EZH2对非小细胞肺癌PD-L1表达的影响及其内在的分子调控机制。研究方法1.EZH2在非小细胞肺癌组织中表达及与PD-L1表达和患者预后的相关性分析。在线下载TCGA数据库中肺癌的基因芯片数据,分析EZH2在肺癌及正常肺组织中的表达情况;收集NSCLC患者组织样本,采用qPCR技术检测EZH2在癌组织及正常组织中的表达;通过ProgGene V2和Kaplan-Meier绘图仪分析EZH2与肺癌患者预后的关系;结合GEO DataSets中肺癌基因芯片结果及非小细胞肺癌组织的qPCR检测分析EZH2表达水平与PD-L1表达的相关性,以此揭示EZH2在NSCLC中的表达情况及其与PD-L1表达和患者预后的关系。2.体外分析EZH2对非小细胞肺癌PD-L1表达的影响。分别采用sh-EZH2慢病毒敲低和EZH2抑制剂GSK343抑制小鼠肺癌细胞株LLC中EZH2的表达后,流式细胞、qPCR等检测肺癌细胞PD-L1表达水平变化。通过上述体外实验验证EZH2对非小细胞肺癌细胞PD-L1表达的影响。3.体内验证EZH2的抑制对非小细胞肺癌PD-L1表达及肿瘤免疫反应的影响。EZH2稳定敲低的LLC细胞皮下注射C57小鼠,荷瘤后观察肿瘤的生长以及体积重量,并通过流式细胞分析等检测非小细胞肺癌PD-L1的表达及肿瘤免疫反应变化。4.EZH2调控非小细胞肺癌细胞PD-L1表达的机制研究。通过qPCR、流式分析EZH2敲低后LLC中HIF-1α表达水平的变化以明确EZH2对非小细胞肺癌HIF-1α的调控作用。进而通过缺氧刺激上调LCC中HIF-1α的表达观察HIF-1α是否是PD-L1的上游调控分子。最后结合缺氧诱导加EZH2敲低,观察LLC细胞PD-L1的表达水平,证实HIF-1α是否是EZH2调控非小细胞肺癌PD-L1表达的确切分子机制。研究结果1.EZH2在NSCLC组织中表达增多并与PD-L1表达和患者预后不良呈显著的正相关。TCGA数据库基因芯片数据分析表明EZH2在肺癌组织中异常过表达。类似的,在医院收集的20例NSCLC组织样本中,肺癌组织EZH2的mRNA水平显著高于正常肺组织,表明EZH2在NSCLC中表达显著增多,提示EZH2是一个潜在的NSCLC的标志物。PROGgene V2和Kaplan-Meier Plotter在线数据库生存分析结果显示,EZH2高表达组患者的总体生存期及无复发生存期较低表达组均明显降低,可见EZH2的表达水平与患者生存预后呈显著的负相关。进一步对GEO DataSets数据库中肺癌基因芯片的结果进行深入分析发现,肺癌组织中EZH2表达与PD-L1表达呈显著的正相关,与20例NSCLC临床组织样本的结果一致。上述结果表明EZH2在NSCLC组织中异常过表达,并与PD-L1表达和患者的不良预后呈显著的正相关。2.体外实验证实抑制EZH2可减少NSCLC细胞PD-L1的表达。shEZH2慢病毒敲低LLC细胞中EZH2的表达,转染效率检测显示shEZH2-2组最为显著。qPCR、WB和流式细胞技术观察EZH2敲低后LLC细胞中PD-L1的表达变化,发现PD-L1表达显著下降,且PD-L1的下降水平与EZH2的敲低效率密切相关。类似的,EZH2抑制剂GSK343干预LLC细胞24小时后,流式细胞结果显示,与对照组相比,GSK343治疗组PD-L1的平均荧光强度显著降低,并呈现出良好的剂量依赖效应。上述体外实验结果表明,EZH2可以调控LLC细胞中PD-L1的表达。3.体内实验证实敲低EZH2可抑制NSCLC细胞PD-L1的表达,从而增强抗肿瘤免疫反应,延缓肺癌进展。荷瘤实验结果显示,shEZH2组肿瘤的生长速度及体积重量均明显低于对照组。通过流式细胞分析发现,shEZH2敲低组与对照组相比,其PD-L1的平均荧光强度显著降低。进一步分离肿瘤组织,经流式细胞检测分析,shEZH2组的肿瘤内浸润性CD8+T细胞比例显著高于对照组,CD8+T细胞分泌的功能性IFN-γ的比例亦显著增加,表明EZH2敲低后,NSCLC中PD-L1的表达下降,CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应增强,从而延缓了肺癌的进展。4.EZH2可通过HIF-1α调控非小细胞肺癌中PD-L1的表达。shEZH2转染LLC细胞后,HIF-1α的表达水平显著下降,表明EZH2对非小细胞肺癌HIF-1α高表达的维持具有重要促进作用。进一步通过低氧诱导LLC细胞,qPCR和流式分析均提示低氧环境下高表达的HIF-1α可上调LLC细胞中PD-L1的表达,在此基础上配合HIF-1α抑制剂IOX2干预,LLC细胞的PD-L1表达下降。从正向刺激和负向干预的两个水平证明HIF-1α是非小细胞肺癌PD-L1高表达的重要维持因素。为了进一步探究EZH2、HIF-1α和PD-L1之间的相关性,LLC细胞在缺氧诱导的基础上给予shEZH2敲低发现,缺氧+EZH2敲低组LLC细胞的PD-L1的转录水平较单纯缺氧组亦显著下降,表明EZH2是HIF-1α诱导PD-L1表达的上游调控分子。综上所述,EZH2可以通过HIF-1α调节NSCLC细胞中PD-L1的表达。研究结论1.EZH2在NSCLC组织中表达增多,并与PD-L1水平和患者预后不良呈显著的正相关。2.EZH2敲低可抑制NSCLC中PD-L1的表达,从而通过增强体内抗肿瘤免疫反应,延缓NSCLC的进展。3.EZH2可通过HIF-1α调控非小细胞肺癌中PD-L1的表达。