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在传统的真菌遗传分析中,常用化学和物理的方法诱导原始菌株产生突变子,然后分析突变基因所具有的功能特性,但是利用此种方法分离突变基因是一项非常困难而又繁琐的工作。本实验采用限制性内切酶介导整合技术(REMI)转化木霉菌T23菌株原生质体,创制插入突变株,取得了以下研究进展。
1.本文研究了木霉菌T23菌株原生质体制备及再生条件,并对原生质体的释放和再生过程进行了系统的观察。结果表明,木霉菌T23菌株原生质体制备的最佳条件:菌龄为24h,裂解酶采用崩溃酶,酶浓度为15mg/mL,酶解时间在3-4h之间,酶解温度以30-35℃时最为适合。观察到木霉菌以菌丝断裂方式释放原生质体,以产生不规则突出的方式进行再生。
2.经REMI转化后共获得原生质体再生菌落289个,通过继代培养、抗潮霉素稳定性测定共获得转化子178个。
3.通过特异性PCR扩增,证实转化子阳性率为96.6%。通过Southern分子杂交方法分析了外源质粒在转化子中的整合,进一步证明外源质粒pV2确已整合到木霉菌T23的基因组内。
4.经REMI转化后部分转化体菌株生物学特性发生了很大变化。
5.多数转化子在抑菌能力和枯萎病防治能力方面均有明显改善。
6.用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对木霉菌出发菌株T21及其4株转化子的可溶性蛋白和酯酶进行了比较。研究发现各转化子之间,转化子与出发菌株之间的谱带均有差异。外源质粒插入木霉菌染色体之后的突变涉及酶蛋白的改变,为今后进一步定位和克隆生防相关基因奠定理论基础。
7.首次发现不同转化子与不同宿主植物间存在专化性互作现象。