莱姆病(Lyme disease)是由蜱传播的自然疫源性疾病。该病的典型临床症状为游走性红斑,主要侵害心脏、关节、神经,一旦感染,会对机体造成不可逆性损伤。小型哺乳类动物是蜱虫的主要宿主。随着经济发展,人与宠物的频繁接触增加了人患莱姆病的潜在风险,使得莱姆病成为全球广泛关注的人兽共患病。由于莱姆病的临床表现复杂多样,病原体分离困难且耗时长,因此该病常不能被及时确诊,进而错过最佳治疗时间。目前,该病的检测方法常选用出现时间早、抗原性强、持续性久的菌体蛋白作为检测抗原,但这些菌体蛋白存在一定的异质性,易造成检测效果不佳,对我国莱姆病的预防和控制极为不利。因此,根据我国的实际流行情况,建立与流行致病基因型相匹配的检测方法刻不容缓。在预防莱姆病的过程中,疫苗免疫是预防莱姆病最有效的方式,但国际上至今无人用商品化疫苗来预防莱姆病。当前,莱姆病疫苗的研制主要集中在全菌疫苗、亚单位疫苗等,这些疫苗的安全性差、免疫原性低,因此围绕绿色环保理念,研发安全高效的莱姆病新型疫苗已迫在眉睫。针对以上问题,本研究旨在建立用于检测犬莱姆病的间接ELISA方法,以期为我国犬莱姆病检测提供一种快速、有效的临床诊断方法。其次,利用不同的构建策略将伯氏疏螺旋体外膜表面蛋白A(outer surface protein A,OspA)嵌合至新城疫病毒样颗粒(Newcastle disease virus-like particles,NDV VLPs)膜表面,通过比较构建出的不同嵌合病毒样颗粒(Chimeric virus-like particles,cVLPs),找到嵌合OspA蛋白最多的cVLPs。最后,将最佳的犬莱姆病cVLPs进行免疫原性研究,进一步探究其是否具有潜在的应用价值,以期为莱姆病新型疫苗的研究提供新的思路。主要研究内容如下:1、建立检测犬莱姆病的间接ELISA方法本研究选用我国流行的致病基因型咖氏疏螺旋体(Borrelia garinii,B.g)和国际普遍存在的致病基因型狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu stricto,B.b.s.s)的外膜表面蛋白C(outer surface protein C,OspC),通过原核表达系统表达两种蛋白,经SDS-PAGE、Western Blot鉴定后,进一步纯化B.g OspC、B.b.s.s OspC。将两种OspC蛋白共同作为抗原包被于ELISA酶标板中,对抗原包被量、血清稀释比例、酶标抗体工作浓度等多个环节进行优化,建立了一种可行的ELISA检测方法,为我国犬莱姆病抗体样品的临床检测提供了技术支持。2、犬莱姆病cVLPs-rdHN OspA的构建本研究以NDV VLPs为载体,构建含OspA蛋白的cVLPs。具体如下:分别以GPI OspA(GPI锚定OspA)、rdHN OspA(去除胞外域的HN连接OspA)、HN OspA(HN全长连接OspA)三种策略构建cVLPs,通过昆虫杆状病毒表达系统分别表达cVLPs-GPI OspA、cVLPs-rdHN OspA、cVLPs-HN OspA,经Western Blot鉴定和透射电镜观察,鉴定三种cVLPs是否构建成功,随后,通过比较cVLPs上OspA的蛋白含量,选择最佳的cVLPs。研究结果表明,构建的cVLPs-GPI OspA和cVLPs-rdHN OspA可以在透射电镜下观察到规则的表面纤突,能够正确嵌合OspA至NDV VLPs膜表面。同时,cVLPs-rdHN OspA嵌合的OspA蛋白最多。综上,构建的cVLPs-rdHN OspA为最佳的cVLPs。3、犬莱姆病cVLPs-rdHN OspA的免疫原性研究本研究将上述筛选到的cVLPs-rdHN OspA作为试验组,同时设立soluble rOspA组(原核表达OspA组)、VLPs-M组(不携带外源蛋白的NDV VLPs组)、PBS组进行分析评估。采用腹腔注射对BALB/c小鼠进行免疫,一方面通过尾静脉采血获得血清抗体,经ELISA检测比较各组小鼠体液免疫应答情况;另一方面,取各组小鼠脾脏分离淋巴细胞,经荧光抗体染色后,进行流式细胞术分析,通过CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞的比值变化,比较各组小鼠细胞免疫应答情况。研究结果表明,与soluble rOspA组、VLPs-M组、PBS组相比,cVLPs-rdHN OspA组展示出较快、较高的抗体水平,并且CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞的比值显著增高。因此,cVLPs-rdHN OspA组可以刺激机体产生更高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答。综上,与原核表达OspA相比,cVLPs-rdHN OspA组具有更好的免疫原性,为犬莱姆病新型疫苗提供了新思路。