胶原的制备及其对可植入生物材料表面改性研究

来源 :哈尔滨工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:thomas962
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胶原是目前生物材料界研究最多的天然生物材料之一,并且被广泛应用于临床医学。胶原用作为细胞和基因载体的三维立体凝胶支架,以及在非天然生物材料表面工程中的应用是目前研究的热点。  本文从提取胶原入手,以牛腱(T)为原材料,采用酸水解法和酶消化法提取胶原,同时对胃蛋白酶(P)和无花果蛋白酶(F)消化提取胶原的工艺进行优化。实验表明,P:T=1:10和F:T=1:100的消化效果最好;并且从酶促反应动力学的角度给予解释。通过高速离心、盐析和透析对粗胶原提纯,选用NaCl进行盐析。通过常规氨基酸分析、羟脯氨酸含量测定、红外(IR)和紫外光谱分析以及等电点凝结实验确认提取物是胶原,同时从羟脯氨酸含量和SDS-PAGE凝胶电泳分析确定胶原纯度较高,分子量大概在300KDa左右;胃蛋白酶提取胶原提取率在75%左右;通过原子力显微镜观察分析酸性提取液中的胶原的聚集态行为。选用戊二醛(GTA)对胶原进行交联,通过扭辫分析、DSC和IR分析确定醛基与胶原的端氨基之间以C=N键形式交联,交联后胶原抗拉强度提高,抗酶降解和生理盐水降解的能力增强;实验确定浓度为0.2%(V/V)的GTA对胶原交联60min效果最理想。  本文研究了酶消化法提取胶原在凝胶中的自组装行为,发现胶原通过磷酸盐缓冲溶液透析后获得的凝胶(PBS-凝胶)性能比较优越;电镜观察发现PBS-凝胶中的胶原纤维组装成天然横纹结构。利用胶原凝胶制备的三维立体支架培养小鼠胚胎内皮成纤维细胞(3T3),根据3T3细胞在不同时期的生长状态,确定提取的胶原可以用作细胞的三维立体生长支架,细胞在胶原凝胶中生长状态良好。  由于胶原是细胞外基质的主要成份,在聚氨酯(PU)和乙丙交酯共聚物(PLGA)表面接枝胶原,可提高其细胞相容性。本文选择紫外、臭氧化和等离子体处理三种方式对材料进行活化来接枝胶原。通过人类宫颈癌细胞(Hela)培养确定合适的处理方法。在长期培养过程中,经过紫外和臭氧化处理的材料易降解而使细胞大量死亡,因此实验选用等离子体处理进行胶原接枝。通过测定等离子体处理后PU和PLGA材料表面水接触角确定最佳处理功率为60W,时间5min。FTIR结果表明,PU经过等离子体处理后,通过羧基和过氧基使胶原成功地接枝到PU表面。XPS分析确定胶原表面的羧基与PLGA表面等离子体激活的羟基发生了反应生成酯基接枝到PLGA表面。选用人脐静脉内皮细胞(ECV)和小鼠胚胎内皮成纤维细胞(3T3)在PU和PLGA材料表面培养。实验定性观察确定胶原接枝有利于细胞的粘附和增殖。采用ImageJ软件分析田字形九点取相法和四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)对不同时期两种细胞生长情况进行定量分析,结果表明,接枝胶原的存在改善细胞粘附了,加快了细胞的增殖速度。  采用低温等离子体技术在PU表面接枝胶原,并制备胶原/聚氨酯(COL/PU)复合材料,对PU表面进行伪饰。用碘代法检测等离子体处理后PU(P-PU)表面活性基团浓度。本文选择两种方法接枝胶原,直接在P-PU表面接枝胶原称为一步法,先在P-PU表面接枝中间体再接枝胶原称为两步法;通过表面接枝密度的测定、胶原的粘接强度测试及XPS分析确定一步法优于两步法。将PU和COL/PU在小鼠皮下埋植,通过定期取材和TEM观察发现,COL/PU复合材料与机体相容性很好,急性炎症反应在植入后第7天消失,材料被组织包裹形成包囊,而且包囊壁随时间逐渐变薄;而PU材料在植入1个月后炎症反应还没彻底消失,PU与机体粘附性不好,PU没有完全被组织包裹形成包囊,易发生迁移。结果表明,COL/PU复合材料具有良好组织相容性及组织引导再生能力,胶原层的存在对PU的保护和固定的作用。
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