正已烷(n-hexane，CAS：110-54-3)，别名己烷，属于直链饱和脂肪烃类，2,5-己二酮(2,5-hexanedione，2,5-HD)是正己烷体内代谢的主要活性产物，与正己烷的毒性有关。正己烷作为有机溶剂被广泛应用的同时，如职业接触防护不当，特别是女工职业接触机会较多，会导致器官结构与功能的损伤。国内外对正己烷和2,5-HD毒性作用进行了较为广泛地研究，但主要集中在神经毒性方面，对生殖系统的毒理损伤，尤其是对女性生殖功能的影响报道较少，其毒性作用机制还有待进一步认识。2005年，有学者首次报道了来源于小鼠卵巢颗粒细胞的Hedgehog信号通路，随后研究较多的是Sonic hedgehog(SHH)。SHH信号通路对许多组织细胞增殖、分化、凋亡的调控以及在生殖腺(睾丸、卵巢)、子宫和附属性腺(前列腺、乳腺)等生殖系统中的研究是近几年的热点。因此，本研究采用体外培养的人卵巢颗粒细胞为靶细胞，通过建立和优化体外分离和培养人卵巢颗粒细胞的培养体系，研究2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制及SHH信号通路在该过程中的调控作用，可以为明确2,5-HD对女性生殖功能的毒性损伤、作用机理以及涉及该通路的调控机制提供重要的参考依据，以期为进一步开展缓解或阻断2,5-HD致卵巢毒性损伤的研究奠定理论基础。目的：通过建立高效、稳定的体外分离、培养、鉴定人卵巢颗粒细胞的研究体系，从人卵巢颗粒细胞凋亡的形态学变化及与细胞凋亡有关的BCL-2家族(BCL-2、BAX)和CASPASE家族(CASPASE-3)的表达变化，探讨2,5-HD致卵巢毒性的作用机制。同时，研究Sonic hedgehog信号通路在2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用方式及其作用机制，为进一步研究如何缓解或阻断2,5-HD致卵巢毒性损伤提供新思路。方法：1.分离行辅助生殖助孕技术治疗的、符合研究纳入标准的、不孕患者的卵巢颗粒细胞，采用梯度离心、红细胞裂解液裂解及胰蛋白酶消化等方法，分离人卵巢颗粒细胞。同时，采用苏木素-伊红(HE)染色、促卵泡生成素受体(FSHR)免疫组化染色对分离细胞进行鉴定，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，并对体外培养细胞的雌二醇(E2)、孕酮(P)分泌功能进行测定。2.以体外培养48h的人卵巢颗粒细胞为靶细胞，采用2,5-HD终浓度为0、16μmol/L、64μmol/L和256μmol/L的DMEM培养液体外染毒24h，通过采用HE染色、Hoechst33342荧光染色、CASPASE-3p17免疫组化染色、透射电镜以及流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测2,5-HD诱导人卵巢颗粒细胞凋亡的改变。再进一步采用realtime PCR和Western blot法，分别检测与细胞凋亡有关的BCL-2家族(BCL-2、BAX)和CASPASE家族(CASPASE-3)的mRNA、蛋白水平随着2,5-HD染毒浓度的增加其表达量的变化情况。3.选择研究致人卵巢颗粒细胞凋亡效应最显著的256μmol/L2,5-HD体外染毒24h过程的颗粒细胞和正常对照组颗粒细胞为研究对象，采用realtime PCR，测定内源性SHH信号通路在2,5-HD作用24h致人卵巢颗粒细胞凋亡过程中的mRNA的表达改变；采用Western blot法，测定内源性SHH信号通路主要效应分子SHH、GLI1在2,5-HD作用24h致人卵巢颗粒细胞凋亡过程中的蛋白表达改变情况。同时，通过测定外源性重组SHH因子和SHH信号通路阻滞剂Cyclopamine对SHH信号通路的激活或阻断，来进一步验证SHH信号通路对2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡率的影响，以及对抗凋亡基因BCL-2和凋亡基因BAX mRNA、蛋白的影响。结果：1.人卵巢颗粒细胞分离、原代培养与鉴定体系的建立：(1)台盼蓝染色显示实验分离的人卵巢颗粒细胞存活率>90%，细胞表达FSHR的阳性率>95%。(2)光镜下观察到，人卵巢颗粒细胞体外生长速度较慢，培养2d后细胞明显增殖，细胞与细胞之间有丝状突起相连；第6-7d时细胞逐渐变形、退化。(3)采用CCK-8法测定细胞增殖曲线显示，人卵巢颗粒细胞随着体外培养时间的延长而增殖,培养24h时细胞处于贴壁生长期，在培养第3-5d时达到分裂高峰，随后第6-7d细胞开始逐渐退化。(4)体外培养的人卵巢颗粒细胞在重组人促卵泡激素(rFSH)作用下可明显促进E2的分泌，但分泌孕酮(P)的能力与rFSH的作用无关，体外分离、原代培养的人卵巢颗粒细胞保持了原有细胞的功能特性。2.2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡机制的研究：本研究建立了2,5-HD诱导的人卵巢颗粒细胞凋亡模型，由相差显微镜、光镜、荧光显微镜和透射电镜可观察到特征性的凋亡形态学改变，且随着2,5-HD染毒浓度的增加出现凋亡形态学改变的人卵巢颗粒细胞会逐渐增多。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，2,5-HD终浓度为64μmol/L、256μmol/L时可显著增加颗粒细胞的凋亡率。realtime PCR结果显示，随着2,5-HD染毒浓度的增加，BCL-2mRNA水平呈下降趋势，BAX、CASPASE-3mRNA水平呈上升趋势。Western blot与realtime PCR结果相一致，表现为随着2,5-HD染毒浓度的增加，BCL-2蛋白表达呈下降趋势，凋亡蛋白BAX、凋亡下游执行蛋白CASPASE-3(p17)表达呈上升趋势。3. Sonic hedgehog信号通路在2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡过程中的调控作用：(1)对照组人卵巢颗粒细胞在体外培养过程中，有少量SHH信号通路组分表达，但随时间改变无明显改变；在2,5-HD作用24h过程中，颗粒细胞SHH、PTCH1、SMO以及GLI1mRNA水平在3h、6h时分别与对照组比较差异显著；SHH、SMO和GLI1mRNA水平在24h时均有下降；GLI2和GLI3mRNA水平与对照组比较在不同时间差异均无统计学意义；人卵巢颗粒细胞SHH、PTCH1、SMO以及GLI1mRNA水平在3h、6h时升高分别为对照组的2-5倍、5-8倍，随后于24h时降到低值。(2)与realtime PCR结果相一致，对照组人卵巢颗粒细胞在体外培养过程中，SHH信号通路主要效应分子SHH、GLI1蛋白有少量表达，随时间改变无明显差异；在2,5-HD作用24h过程中，颗粒细胞SHH和GLI1蛋白水平在3h、6h时升高分别与对照组比较差异显著，在24h时均有下降。(3)外源性SHH因子可增加人卵巢颗粒细胞的存活率，减少2,5-HD作用导致的细胞凋亡；用外源性Cyclopamine阻滞SHH信号通路会增加人卵巢颗粒细胞的凋亡率。(4)在2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡过程中采用外源性重组SHH因子处理会导致抗凋亡基因BCL-2表达上调，凋亡基因BAX表达下降。结论：1.采用本研究所建立的方法可获得生长活性较好、细胞纯度高及稳定的人卵巢颗粒细胞，用HE染色和FSHR免疫组化染色法可简便快速地鉴定人卵巢颗粒细胞。2.2,5-HD通过诱导人卵巢颗粒细胞BCL-2家族中凋亡基因(BAX)表达上升和抗凋亡基因(BCL-2)表达下降，引起凋亡下游执行蛋白CASPASE-3(p17)表达上升，进而导致颗粒细胞的凋亡增加，有可能是其致卵巢功能受损的机制之一，明确BCL-2家族对2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制，可以为女性生殖毒性损伤的临床诊断、确定分子治疗靶点的研究提供参考依据。3.体外培养的人卵巢颗粒细胞有少量SHH信号通路组分表达。在2,5-HD致人卵巢颗粒细胞凋亡过程中SHH信号通路会被激活，起到了降低颗粒细胞凋亡的保护性作用，其作用机制有可能是通过调节抗凋亡基因BCL-2和凋亡基因BAX的表达改变，来阻止或缓解2,5-HD诱导的细胞凋亡。