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实验目的本研究以卵巢切除（OVX）大鼠作为肾虚型骨质疏松症（OP）模型,基于Hedgehog-GLi信号通路探讨补肾方药左归丸对卵巢切除所致骨质疏松大鼠的治疗作用及机理。以期进一步阐明“肾主骨”机理,为中医治疗骨质疏松提供科学依据。实验方法3月龄SD大鼠72只,入组后适应性饲养,随后按体重标准随机性分为三组,空白对照组（n=12）,假手术组（n=15）,造模组（n=45）。造模组大鼠麻醉后行双侧卵巢切除术,制备“肾虚”的OP大鼠模型。假手术组大鼠仅切除卵巢周围脂肪组织,其余手术过程同于造模组。9只大鼠因麻醉及手术原因死亡,假手术组大鼠减少至12只。切除卵巢12周后,按照体重将造模组随机分为3组:卵巢切除组（OVX组）、OVX+雌激素组（阳性对照组）、OVX+左归丸组（左归丸组）,每组13只。分组后给药,一天一次,连续六天,休息一天。如此给药12周。每周检测大鼠体重以调整药量。给药结束,麻醉后处死各组大鼠,取双侧胫骨和股骨,分别用于Micro-CT检测骨密度、骨组织形态学指标以及制作冰冻切片,采用免疫组化和原位杂交两种方法检测胫骨骨髓基质细胞中Ihh、Ptch、Smo、Gli1、OPG、RANKL的蛋白及mRNA的表达。实验结果1左归丸对卵巢切除大鼠股骨骨密度（BMD）的影响与假手术组相比,OVX组、阳性对照组、左归丸组股骨BMD均显著降低（P＜0.01）;与OVX组相比,阳性对照组、左归丸组股骨骨密度均明显增高（P＜0.01,P＜0.05）。2左归丸对卵巢切除大鼠股骨骨组织形态学指标的影响2.1左归丸对卵巢切除大鼠股骨BV/TV的影响OVX组股骨BV/TV值显著低于假手术组（P＜0.01）;与OVX组相比,阳性对照组和左归丸组BV/TV值均显著升高（P＜0.01）,但仍低于假手术组（P＜0.01）。2.2左归丸对卵巢切除大鼠股骨SMI的影响OVX组股骨SMI显著高于假手术组（P＜0.01）;阳性对照组和左归丸组股骨SMI与OVX组相比均明显降低（P＜0.01,P＜0.05）,但仍显著高于假手术组（P＜0.01）。2.3左归丸对卵巢切除大鼠股骨Tb.Th的影响各组大鼠股骨Tb.Th无统计学差异（P＞0.05）。2.4左归丸对卵巢切除大鼠股骨Tb.N的影响OVX组、阳性对照组、左归丸组股骨Tb.N均显著低于假手术组（P＜0.01）;阳性对照组和左归丸组股骨Tb.N均比OVX组显著增高（P＜0.01）。2.5左归丸对卵巢切除大鼠股骨Tb.Sp的影响与假手术组相比,OVX组股骨Tb.Sp显著升高（P＜0.01）;与OVX组相比,阳性对照组和左归丸组Tb.Sp均显著降低（P＜0.01）,但仍显著高于假手术组（P＜0.01）。3左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中Hedgehog信号通路关键因子Ihh、Ptch、Smo及Gli1表达的影响3.1左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中Ihh mRNA及蛋白表达的影响OVX组、阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中Ihh mRNA及蛋白表达水平较假手术组明显升高（P＜0.01,P＜0.05）;与OVX组相比,阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中Ihh mRNA及蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）。3.2左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中Ptch mRNA及蛋白表达的影响OVX组大鼠胫骨骨髓基质细胞中PtchmRNA及蛋白表达水平均显著高于假手术组（P＜0.01）;阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中Ptch mRNA及蛋白表达水平显著低于OVX组（P＜0.01）,但仍明显高于假手术组（P＜0.05）。3.3左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中Smo mRNA及蛋白表达的影响OVX组大鼠胫骨骨髓基质细胞中Smo mRNA及蛋白表达水平较假手术组大鼠显著升高（P＜0.01）;阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中Smo mRNA及蛋白表达水平较OVX组显著降低（P＜0.01）,但左归丸组仍明显高于假手术组（P＜0.05）,阳性对照组与假手术组无差异（P＞0.05）。3.4左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中GLi1 mRNA及蛋白表达的影响与假手术组相比,OVX组大鼠胫骨骨髓基质细胞中GLi1 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,与OVX组相比,阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中GLi1 mRNA及蛋白表达量均降低（P＜0.01）,但仍明显高于假手术组（P＜0.05）。4左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中OPG、RANKL mRNA及蛋白表达及RANKL/OPG值的影响4.1左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中OPG、RANKL mRNA表达及RANKL/OPG的影响与假手术组相比,OVX组胫骨骨髓基质细胞中OPG mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）,RANKL mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）,RANKL/OPG比值显著增大;阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中OPG mRNA表达水平较OVX组均显著升高（P＜0.01）,但仍较假手术组低（P＜0.05,P＜0.01）;RANKL mRNA表达水平较OVX组显著降低（P＜0.01）,RANKL/OPG 比值显著下降（P＜0.01）,但仍明显较假手术组高（P＜0.05,P＜0.01）。4.2左归丸对卵巢切除大鼠胫骨骨髓基质细胞中OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG的影响OVX组胫骨骨髓基质细胞中OPG蛋白表达水平比假手术组显著降低（P＜0.01）,RANKL蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,RANKL/OPG 比值显著增大（P＜0.01）。阳性对照组、左归丸组大鼠胫骨骨髓基质细胞中OPG蛋白表达水平较OVX组均显著升高（P＜0.01）,左归丸组仍明显低于假手术组（P＜0.05）,阳性对照组与假手术组无差异（P＞0.05）。阳性对照组、左归丸组RANKL蛋白表达水平均较OVX组显著降低（P＜0.01）,RANKL/OPG 比值显著下降（P＜0.01）,但仍显著高于假手术组（P＜0.01）。实验结论（1）卵巢切除6个月能使大鼠出现明显骨质疏松。卵巢切除后,Hedgehog信号通路的关键因子Ihh、Ptch、Smo、GLi1 mRNA及蛋白表达水平明显增高,Hedgehog信号通路异常活跃;进而使RANKL/OPG比值增高,OC活性异常增强,骨量减少,发生骨质疏松症。（2）左归丸对卵巢切除大鼠的骨质疏松症有明显的治疗作用。左归丸可抑制卵巢切除所致的Hedgehog信号通路异常活跃,使其关键因子Ihh、Ptch、Smo、GLi1 mRNA及蛋白表达水平明显降低;进而降低RANKL/OPG比值,抑制破骨细胞活性,防止骨量丢失。以上研究结果提示,Hedgehog信号通路在“肾主骨”过程中起着重要作用。