腹泻是一种常见的临床症状,常常由于各种感染性或非感染性因素引起,主要表现为便次增多超过平时的频率,粪便的含水量增加,日排便量达200 g以上,偶尔还会含有食物残渣、脓血或粘液,腹泻往往还伴随着排便急迫感及肛门不适、失禁等症状。目前西医临床治疗通常采用对症治疗和病因治疗,包括补液纠正电解质紊乱、应用抗生素抑制肠道感染等。抗生素长期使用易产生耐药性,而滥用还可能会导致肠道菌群失调,引发医源性腹泻。中药因其疗效确切、毒副作用小等因素在治疗急慢性腹泻方面有着其独到的优势。满药柞树皮(Mongolian oak bark),为壳斗科植物蒙栎的树皮,味微苦、涩,性平。据《吉林中草药》《全国中草药汇编》中记载:柞树皮具有清热解毒,消肿利湿的功效,主治细菌性痢疾、急性胃肠炎、小儿消化不良、黄疸等疾病。本研究主要通过在体实验及细胞实验两方面对满药柞树皮治疗腹泻类疾病进行了药效学和药理作用机制探究。实验首先采用番泻叶灌胃复制大鼠腹泻模型,利用不同剂量柞树皮水煎剂进行干预,研究柞树皮对模型大鼠的治疗作用,以及对肠道运动、组织病理和结肠中水通道蛋白3,4(AQP3,AQP4)表达水平的影响,然后体外培养大鼠肠道cajal间质细胞(ICC),筛选出合适的柞树皮药效浓度后利用工具药乙酰胆碱、阿托品对细胞进行刺激造模,基于cAMP-PKA细胞信号通路,利用分子生物学技术测定细胞中cAMP,PKA,CREB,p CREB表达水平,探究柞树皮治疗腹泻的药理作用机制是否与cAMP-PKA细胞信号通路及调控水通道蛋白3、4有关。第一部分满药柞树皮止泻的药效学研究目的:观察柞树皮水煎剂对腹泻模型大鼠的腹泻指数及结肠运动功能的影响,评价其疗效。方法:1动物分组及造模60只SD大鼠随机分为6组,六组分别为:正常对照组,模型对照组,阳性对照组,柞树皮低剂量组,柞树皮中剂量组和柞树皮高剂量组。除正常组使用生理盐水灌胃外,其余五组每天使用番泻叶进行灌胃,连续一周复制腹泻模型。2药效学观察模型制备完成后,各治疗组使用药物灌胃口服进行治疗,空白组及模型组使用生理盐水灌胃。观察模型组和治疗组大鼠一般行为和状态,记录大鼠的腹泻情况,最终以6小时内的腹泻指数作为评价指标。3大鼠结肠压力数据采集使用四导生理记录仪对各组大鼠的在体结肠运动曲线进行描记,计算随机5 min内的结肠运动指数并取其均值。4制作结肠组织切片截取大鼠远端结肠组织制作病理切片进行HE染色,观察各组大鼠结肠病理改变情况。结果:1番泻叶造模结果:在使用番泻叶连续灌胃一周后,对比空白组,造模大鼠腹泻率达到100%,肛周可见黄色稀便附着,毛色稍显晦暗,行为无明显改变,模型制备成功。2柞树皮对模型大鼠腹泻指数影响:用药治疗后模型大鼠的稀便次数和腹泻指数等指标与单纯造模的大鼠相比均有所下降,其中阳性对照组及柞树皮中、高剂量组对比模型组具有明显差异(P<0.01),高剂量效果最优,低剂量下降趋势小于其他治疗组。3柞树皮对模型大鼠结肠运动指数影响:对数据进行分析后可以发现造模成功后大鼠的结肠指数对比正常组明显上升(P<0.05),使用药物治疗后阳性对照组、柞树皮中、高剂量组大鼠的结肠运动指数对比模型组均有所下降(P<0.05),其中高剂量组下降趋势更明显(P<0.01),低剂量组未见明显差异(P>0.05)。4柞树皮对模型大鼠的结肠组织病理改变影响:通过在光镜下观察各组大鼠结肠组织HE染色切片,可以发现空白组大鼠肠黏膜结构完整,细胞排列整齐平滑,而造模后大鼠结肠肠壁黏膜有轻度充血水肿,偶见淋巴细胞浸润。在使用柞树皮水煎剂治疗后,对比模型组,大鼠结肠组织充血水肿情况有一定改善,其余与空白组相比无明显差异。结论:运用番泻叶复制大鼠腹泻模型成功,并验证了柞树皮对模型大鼠腹泻的治疗作用。第二部分满药柞树皮治疗腹泻的机制研究目的:通过检测结肠组织中肥大细胞活化状态、ICC数量、AQP3和AQP4的表达,以及ICC中cAMP和PKA水平、CREB和p CREB蛋白表达水平,探究柞树皮的止泻作用机制。方法:1取大鼠远端结肠组织切片后行甲苯胺蓝染色,镜下记录大鼠结肠肥大细胞脱颗粒情况,计算脱颗粒率。2采用免疫组化和WB技术检测结肠组织中AQP3,AQP4的阳性表达和蛋白表达水平,利用c-kit抗体对结肠中的ICC细胞进行阳性标记并计数。3细胞培养及分组:培养大鼠ICC,采用CCK8法筛选出适宜的柞树皮药物作用浓度。将细胞分为正常组,柞树皮低、中、高剂量组,再分别使用工具药阿托品及乙酰胆碱作用于不同组。4采用WB法测定ICC各组中CREB、p CREB蛋白表达水平并进行灰度值分析。5采用Elisa法检测ICC各组中cAMP、PKA的水平。结果:1柞树皮对肥大细胞脱颗粒影响:造模后对比正常组肥大细胞脱颗粒率明显上升,在经过治疗药物干预后的各组脱颗粒率均有所下降(P<0.05),其中柞树皮中、高剂量组脱颗粒率显著下降(P<0.01)。2免疫组化结果:2.1柞树皮对结肠组织ICC数量的影响:造模后大鼠结肠组织ICC数量对比空白组有显著下降(P<0.05),药物干预后阳性对照组和柞树皮中、高剂量组ICC的数量均有所增多,结果具有统计学意义(P<0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(P>0.05)。2.2柞树皮对结肠组织AQP3表达的影响:造模后对比空白组AQP3阳性表达降低(P<0.05),药物干预后阳性对照组及柞树皮中、高剂量组阳性表达有所增多,具有统计学意义(P<0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(P>0.05)。2.3柞树皮对结肠组织AQP4表达的影响:造模后对比空白组AQP4阳性表达升高(P<0.05),各治疗组的阳性表达对比模型组均有所减少,具有统计学意义(P<0.05),其中柞树皮高剂量组阳性表达最低。3 WB实验结果:3.1组织中AQP3蛋白表达水平:造模后对比空白组AQP3的蛋白表达水平降低,有明显差异(P<0.05)。各治疗组的蛋白表达水平都有所升高(P<0.05),其中中剂量组蛋白表达水平最高。3.2组织中AQP4的蛋白表达水平:造模后对比空白组AQP4蛋白表达水平升高,有明显差异(P<0.05),各治疗组AQP4的蛋白表达水平均有所降低,其中阳性对照组及柞树皮中、高剂量组对比模型组有显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。低剂量组与模型组相比无明显差异(P>0.05)。3.3 ICC各组中CREB的表达水平:阿托品组与乙酰胆碱组表达水平对比正常组下降(P<0.05),柞树皮单独给药组与正常组无明显差异(P>0.05);阿托品用药组,随着柞树皮剂量升高,表达水平是走低趋势,乙酰胆碱无明显趋势。3.4 ICC各组中p CREB的表达水平:阿托品组表达水平对比正常组下降(P<0.05),乙酰胆碱组也有下降趋势(P>0.05),柞树皮单独给药组与正常组无明显差异(P>0.05);阿托品用药组,随着柞树皮剂量升高,表达水平也是走低趋势,其中低中剂量组统计学有意义(P<0.05)。乙酰胆碱组无明显趋势。4 Elisa实验结果:cAMP,PKA表达水平的趋势图一致,虽然根据统计学统计未达到显著水平(P>0.05),但通过柱状图可以发现柞树皮单独给药组中,随着剂量升高,cAMP,PKA表达水平也随之增多,而阿托品用药组,随着柞树皮剂量升高,cAMP,PKA表达水平是走低趋势,与乙酰胆碱给药组呈相反关系。结论:满药柞树皮对番泻叶致泻大鼠的止泻作用机制可能与通过cAMP-PKA信号通路调控下游CREB磷酸化及AQP3,AQP4等蛋白表达有关。