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经过长期不懈的努力,疟疾在全球的发病率和死亡人数都有一定程度的下降,但是疟疾仍然是世界上危害最为严重的三大传染病之一。在疟疾的防治措施中,红内期疫苗是最经济有效的方式之一。虽然研究人员对红内期疫苗进行了深入的研究,然而迄今为止,仍然没有一种有效的红内期疫苗应用于临床。目前的研究认为,疟原虫抗原高变异性及裂殖子表面蛋白多态性是红内期亚单位疫苗研制过程中存在的主要问题。近来研究表明,红内期ITV全虫疫苗可以通过诱导宿主产生高滴度疟原虫特异性抗体,从而为宿主提供完全性免疫保护,这为红内期亚单位疫苗的成功研制提供了新的思路。然而,关于红内期全虫疫苗中疟原虫特异性B细胞免疫调节活化机制尚不清楚。PD-1/PD-L信号作为天然免疫系统中十分重要的负性调节成份,最近的研究表明,其在调节滤泡样辅助性T细胞(CD4+follicular helper T cell TFH)活化GC B细胞抗体分泌中发挥着十分重要的作用。同时,在疟疾感染免疫过程中,PD-1/PD-L信号缺失能增强TFH细胞活化B细胞抗体分泌的能力。然而,PD-1/PD-L信号在ITV全虫疫苗诱导GC B细胞活化中的作用还不清楚。在本研究中,我们首先确认PD-1/PD-L信号是否在红内期ITV全虫疫苗中发挥作用,并采用过继转移及体内耗竭实验证实是抗体还是CD4+T细胞参与免疫保护过程。其次,我们对两种免疫小鼠血清疟原虫特异性抗体滴度及脾脏GC B细胞频率进行检测。然后,我们通过检测两种免疫小鼠血清炎症因子浓度及脾脏TFH细胞频率,并采用反向拮抗实验,找到影响PD-1-/-免疫小鼠GC B细胞功能的主要原因。最后,通过检测两种免疫小鼠脾脏TFR细胞和CXCR5+-DC频率,初步探讨影响红内期ITV全虫疫苗TFH细胞功能的机制。一、PD-1缺失显著增强红内期ITV全虫疫苗诱导小鼠的保护性免疫力1.构建约氏疟原虫17XL红内期ITV全虫疫苗模型Balb/c小鼠尾静脉感染约氏疟原虫17XL后,连续腹腔注射氯喹(Chloroquine CQ)15天。在停药休息21天后,腹腔注射P.y 17XL i RBC进行攻击并观察免疫保护效果。结果发现,与未免疫WT小鼠相比,免疫小鼠虽然在攻击后第四天,出现原虫血症,并在第六天达到峰值,但最终其获得了完全性免疫保护。2.PD-1-/-增强小鼠红内期ITV全虫疫苗的保护性:采用P.y l7XL i RBC攻击WT和PD-1-/-两种免疫小鼠,观察小鼠的原虫血症及存活率,发现与正常免疫小鼠相比,PD-1-/-免疫小鼠免疫保护效果明显高于WT免疫小鼠,这说明PD-1/PD-L信号在红内期ITV全虫疫苗中发挥着重要的作用。二、PD-1缺失通过影响GC B细胞疟原虫特异性抗体的分泌,从而增强P.y l7XL红内期ITV全虫疫苗诱导小鼠的免疫性保护力1.P.y l7XL红内期ITV全虫疫苗主要依赖疟原虫特异性抗体提供保护:WT小鼠免疫停药后第三周,分离其血清并过继至正常未免疫小鼠,在用P.y 17XL i RBC攻击后,观察其原虫血症及存活率。结果发现,与未过继免疫小鼠血清组相比,免疫小鼠血清过继组其原虫血症显著降低,并最终获得免疫保护。同时,体内耗竭末次免疫停药三周WT小鼠体内CD4+T细胞,并用P.y 17XL i RBC进行攻击。结果发现,与未耗竭组免疫小鼠相比,CD4+T细胞耗竭WT免疫小鼠原虫血症没有显著变化,这说明P.y 17XL红内期ITV全虫疫苗主要依赖于疟原虫特异性抗体发挥保护作用。2.PD-1-/-全虫免疫小鼠主要通过提高血清疟原虫特异性抗体滴度,从而增强免疫保护效果:分离末次免疫停药后三周小鼠血清,进行疟原虫特异性抗体检测,结果发现虽然两种免疫小鼠血清Ig G1滴度之间没有统计学差异,但PD-1-/-免疫小鼠血清Ig G和Ig G2a滴度明显高于WT免疫小鼠。同时,将两种免疫小鼠血清过继转移至正常未免疫小鼠,在用P.y 17XL i RBC攻击后,发现PD-1-/-免疫小鼠血清过继组其原虫血症显著低于WT免疫小鼠过继组,这说明PD-1-/-红内期ITV全虫疫苗主要是通过增强疟原虫特异性抗体的分泌,从而增强免疫保护。3.GC B细胞频率及数量的增多是PD-1缺失小鼠保护力增强的重要原因:分离末次免疫停药后第7天、9天、11天、14天以及21天小鼠脾脏淋巴细胞,流式检测GC B细胞频率并统计其总细胞数量,结果发现随着时间推移,两种免疫小鼠脾脏GC B细胞的频率及总数均逐步增多。但是,PD-1-/-免疫小鼠GC B细胞频率及总数增长的幅度明显高于WT免疫小鼠,这提示PD-1-/-免疫小鼠可以通过促进GC B细胞活化,增强疟原虫特异性抗体分泌,从而加强免疫保护效果。三、PD-1缺失通过增强血清炎症因子分泌及脾脏TFH细胞活化,从而促进GC B细胞疟原虫特异性抗体分泌1.PD-1-/-免疫小鼠脾脏TFH细胞频率和数量以及血清炎症因子(IFN-γ、IL-10、MCP-1)浓度均显著升高:分离末次免疫停药后第7天、9天、11天、14天以及21天小鼠脾脏淋巴细胞,流式检测TFH细胞频率并统计其总的数量。结果发现,与GC B细胞变化趋势不同的是,脾脏TFH细胞频率及总的数目在免疫停药后第7天达到最高,然后随着时间的推移逐步降低。与WT免疫小鼠相比,PD-1-/-免疫小鼠脾脏TFH细胞频率及细胞数目均明显升高。同时,对免疫停药后21天小鼠血清炎症因子进行检测发现,IFN-γ、IL-10、MCP-1这三种炎症因子在PD-1-/-免疫小鼠血清中的浓度均显著高于WT免疫小鼠。以上结果均提示,PD-1-/-全虫疫苗免疫小鼠可能是通过增强脾脏TFH细胞活化及血清相关炎症因子浓度,从而对GC B细胞疟原虫特异性抗体的分泌进行调节。2.分别反向拮抗PD-1-/-全虫疫苗免疫小鼠血清炎症因子IFN-γ、IL-10、MCP-1均能降低脾脏GC B细胞频率和数目:PD-1-/-小鼠免疫停药后第1天、3天、5天或者第3天、5天、7天、9天以及11天腹腔分别注射IFN-γ、IL-10、MCP-1三种细胞因子的拮抗抗体,并于停药后第7天或14天分别检测总淋巴细胞数目、GC B细胞频率及数目的变化。结果发现,与未拮抗免疫组相比,三组拮抗组小鼠在免疫停药后第7天,其淋巴细胞总数、GC B细胞频率及数目均没有统计学差异。而在免疫停药后第14天检测时发现,三组拮抗小鼠其脾脏淋巴细胞总数、GC B细胞频率及数目较未拮抗免疫组均有显著下降,这提示这三种炎症因子可能维持了脾脏GC B细胞的存活。四、PD-1缺失促进红内期ITV全虫疫苗脾脏TFH细胞活化机制的初步探讨1.PD-1-/-免疫小鼠脾脏TFH细胞活化并不依赖于血清炎症因子IFN-γ、IL-10以及MCP-1:PD-1-/-小鼠免疫停药后第1天、3天、5天或者第3天、5天、7天、9天以及11天腹腔分别注射IFN-γ、IL-10、MCP-1三种细胞因子的拮抗抗体,并于停药后第7天或14天分别检测脾脏TFH细胞频率及数目的变化。结果发现,无论是免疫停药后第7天或14天,细胞因子拮抗组与未拮抗组在TFH细胞频率及数目上均没有统计学差异,这提示血清炎症因子IFN-γ、IL-10以及MCP-1可能不参与PD-1-/-红内期ITV免疫小鼠TFH细胞的调节。2.PD-1-/-免疫小鼠脾脏TFH细胞功能的增强可能并不依赖于DC活化:小鼠免疫后第2天、4天、6天,分离其脾脏淋巴细胞并检测CXCR5+DC表面共刺激分子表达。结果发现,虽然三种共刺激分子CD86、MHC-II、CD40在两种免疫小鼠均有不同程度的活化,但它们之间却没有明显的差别,这提示PD-1-/-免疫小鼠TFH细胞数量的增多可能与DC细胞初始的活化关系不大。3.PD-1-/-免疫小鼠脾脏TFH细胞活化并不依赖于脾脏TFR细胞功能:分离免疫停药后第7天、14天以及21天小鼠脾脏淋巴细胞,流式检测脾脏TFR细胞频率的变化。结果发现,虽然两种免疫小鼠在免疫停药后第14天,TFR细胞频率均显著下降,但是无论是Na?ve还是PD-1-/-免疫小鼠,其脾脏TFR细胞频率均比相应WT小鼠要高。这提示我们,PD-1-/-免疫小鼠TFH细胞功能可能不是受TFR细胞所调节。本研究成功建立了P.y l7XL红内期ITV全虫疫苗模型,利用该模型我们发现PD-1/PD-L信号通过影响脾脏GC B细胞疟原虫特异性抗体的分泌,从而在红内期全虫疫苗中发挥重要作用,而PD-1缺失免疫小鼠脾脏GC B细胞的功能与血清炎症因子及TFH细胞密切相关。进一步研究发现PD-1缺失免疫小鼠脾脏TFH细胞活化并不依赖于CXCR5+DC、血清炎症因子(IFN-γ、IL-10、MCP-1)以及TFR细胞功能。本研究首次证实了PD-1/PD-L信号在红内期ITV全虫疫苗有效诱导小鼠产生保护性免疫中的作用,并在一定程度上揭示了红内期ITV全虫疫苗免疫小鼠脾脏GC B细胞活化和调节机制,这可以增强我们对全虫疫苗免疫保护机制的理解,并为亚单位疟疾疫苗设计提供新的理论基础。