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前言:
APP是一种与阿尔茨海默氏病(Alzheimersdisease,AD)的发生、发展密切相关的Ⅰ型跨膜蛋白,具有膜受体样结构。APP基因定位于21号染色体,与遗传学连锁分析定位的早老性AD基因位点相重叠。APP的亚型主要的三种为APP695,APP751,APP770,三种亚型中均包含了Aβ多肽的部分。APP作为一种管家基因(housekeepinggone)在多种组织中均有所表达,但不同组织的APP亚型有所不同,如脑组织中主要为APP695,并且有实验证明在AD患者的脑组织中有APP亚型分布失调的现象。目前研究资料表明,APP对神经突的生长和突触的发生、神经元蛋白沿轴突的运输、跨膜信号的传导、细胞粘附、钙代谢起作用,但是都缺乏体内试验的证实。跨膜的APP由假定的α分泌酶催化裂解成为由膜外部分构成的可溶性分泌片段sAPPα。而经β分泌酶催化裂解后再被γ分泌酶催化裂解则产生Aβ。Aβ具有神经毒性,过量的Aβ能导致神经退行性病变的级联反应使突触功能丧失,在神经细胞外形成老年斑,最终导致神经元功能丧失。相对于Aβ,sAPPα对神经元可塑性和存活、防止神经兴奋性中毒、神经干细胞的增殖、中枢神经系统的发育有重要作用。有文献证明APP基因的复制能引起早老性AD(FAD),另外在小鼠体内APP过表达能导致淀粉样沉积,记忆缺陷,Aβ升高,这些结果说明APP的基因剂量对于AD的发生是一个十分有害的因素。虽然APP的加工代谢得到了很好的研究,但是对于APP稳定性调节还知之甚少,因此影响AAP稳定性调节的因素与Aβ的代谢直接相关。
CystatinC由120个氨基酸构成,最初被鉴定为半胱氨酸蛋白酶抑制剂,也有研究表明CystatinC也具有刺激细胞生长的功能,其与中枢神经系统的关系如下:(1)CystatinC能结合可溶性Aβ,抑制APP转基因小鼠脑内Aβ沉积;(2)在AD病人脑组织和脑脊液中能检测到CystatinC-Aβ复合物;(3)CystatinC能通过诱导功能性自噬维持神经元存活。最近有许多研究表明迟发性AD与CystatinC的基因连锁相关,CystatinC具有抗淀粉样蛋白生成作用。所以CystatinC在阿尔茨海默病发病中起到保护作用。
人脑微血管内皮细胞(HBMEC)形成血脑屏障与Aβ代谢密切相关,但对人脑微血管内皮细胞本身产生APP与Aβ代谢的关系还不是很清楚。本研究通过用CystatinC处理人脑微血管内皮细胞(HBMEC)来检测APP的代谢,从而为研究Aβ的代谢积累新的科学资料,为治疗AD开辟新的方向。
方法:
1、Westernblot方法检测HBMEC中的CystatinC表达;
2、流式细胞术体外分析CystatinC与Aβ形成复合物是否影响HBMEC对Aβ的吞噬:
3、CystatinC处理HBMEC后查APP表达,用AGE,L-NAME,H2O2处理HBMEC作为对照;
4、用CystatinC与H2O2同时处理HBMEC,用westernblot方法检测APP表达,不加CystatinC的H2O2组作对照;
5、利用293T细胞mRNA为模板扩增CystatinC的CDS区,将CystatinC的CDS区(438bp)克隆至真核细胞表达载体pcDNA3.1/myc-HisB。
结果:
1、HBMEC中不表达CystatinC;
2、CystatinC与Aβ形成复合物不影响HBMEC对Aβ的吞噬;
3、CystatinC处理HBMEC后APP表达水平降低;
4、CystatinC能使H2O2引起的APP升高表达降低;
5、成功构建CystatinC的CDS区的真核细胞表达载体。
结论:
1、HBMEC不表达CystatinC;
2、CystatinC与Aβ形成复合物不影响HBMEC对Aβ的吞噬;
3、在体外证明CystatinC处理HBMEC后APP在mRNA水平和蛋白水平表达降低;
4、CystatinC与H2O2同时处理HBMEC后CystatinC能使H2O2引起的APP升高表达降低。