论文部分内容阅读
背景结肠癌是多见的恶性肿瘤之一,其发生的概率在国内外均呈上升倾向,在男女性中发病和死亡的概率均居于各转移性恶性肿瘤的第三位[1]。早期不易发现结肠癌的临床症状及体征,超过一半的病人在确诊结肠癌时已经伴随肺脏或者其它器官的转移,确诊时常已发生转移,而15%以上的病人伴随着肝脏转移[2],结肠癌病死率高,按5年统计,早期生存率约92%,而晚期患者却只有16%[3],所以使得结肠癌治疗的难度加大,而且预后差。尽管目前国内外研究在诊断和治疗结肠癌方面有较大的研究和进步,但目前在胃肠道研究方面早期诊断结肠癌的方法仍然很局限[4]。肿瘤的产生、生长与多种调控基因的活性息息相关。而参与其中的调控基因与蛋白的表达失调和细胞克隆增殖、迁移、侵袭、周期及凋亡紧密相关。抑癌基因ARHI(Aplysia Ras Homolog I,DIRAS3,NOEY2)可以参与相关周期及凋亡调节通路,通过影响通路下游相关蛋白的表达,而发挥生物学活性。其作用可以使正调控周期蛋白如cyclin D1表达明显下降,从而影响周期发展而抑制其无限繁殖。同时可以影响经典的凋亡相关蛋白,如Bcl-2和Bax等,增加凋亡率而达到抑癌作用。本实验研究通过构建重组质粒,将目的基因ARHI成功转染进入结肠癌Ca Co2和SW480细胞株中。通过观察转染后及未转染的细胞株,深入探讨ARHI基因的生物学活性。检测在转染与未转染的细胞中,相关调控蛋白的表达,研究ARHI起作用的方式和信号通路,期待为结肠癌基因层面的治疗提供有用的靶点,为早期诊断及治疗提供理论凭据。目的通过质粒转染技术,利用重组质粒将ARHI转染入选中的实验细胞,挑选出与对照组表达有明显差异的结肠癌细胞株,构建出高表达ARHI基因的稳定株。研究ARHI基因对结肠癌Ca Co2和SW480细胞株凋亡、周期、增殖、克隆形成、侵袭及迁移等影响。经过测试相关蛋白在通路中表达,探索ARHI参与发挥功能的可能机制及可能参与的传导通路。为深入研究ARHI在结肠癌的产生、生长及临床基因层面的治疗供给相关的理论依据。实验方法1.委托上海吉凯基因生物有限公司构建针对目标基因ARHI构建重组质粒,分别为pc DNA3.1-flag和pc DNA3.1-flag–ARHI重组质粒。经过挑选四种不一样的结肠癌细胞系,选出两种满意的为对象细胞系转染,构建出两种ARHI基因高表达的细胞株。每种细胞株分为目标基因pc DNA3.1-flag-ARHI转染组(ARHI)、转染pc DNA3.1-flag空质粒组(vector)。2.采取RT-PCR技术检验ARHI基因在结肠恶性肿瘤细胞与其正常粘膜组织中的差异性表达,从而筛选出低或不表达ARHI基因的结肠恶性肿瘤细胞。3.采用RT-PCR和Western blot技术验证转染后的ARHI m RNA。4.采用Western blot方法测试转染后ARHI基因蛋白及通路相关蛋白的表达。5.利用单克隆形成及CCK8实验检查目的组和空质粒对照组中细胞的增殖能力。6.利用流式细胞技术测试ARHI组和Vector组细胞的周期和凋亡。7.利用Transwell实验测试细胞在ARHI组及Vector组中的侵袭和迁移情况。8.利用统计学SPSS19.0软件对以上实验中所得的数据予统计分析。结果1.ARHI基因在正常粘膜组织中高表达,但在结肠肿瘤细胞系中表现为表达较低甚至不表达。我们选择Ca Co2和SW480两株细胞用于本实验。2.将重组质粒pc DNA3.1-flag和pc DNA3.1-flag-ARHI转入结肠癌Ca Co2和SW480细胞中,从而获得高表达ARHI两种细胞3.CCK8和克隆形成实验结果表示:高表达ARHI能抑制细胞增殖;流式细胞技术测验两组细胞的凋亡,结果提示:pc DNA3.1-flag-ARHI组中细胞凋亡较pc DNA3.1-flag组明显增多;流式细胞技术测验两组细胞的周期,提示:pc DNA3.1-flag-ARHI转染组中处于G0/G1期的细胞明显多于对照组;Transwell迁移及侵袭实验结果提示:pc DNA3.1-flag-ARHI转染组细胞侵袭及迁移能力均弱于pc DNA3.1-flag空载体组。4.重组质粒ARHI组中p-AKT的表达较空质粒组中表达降低,而p53和GSK-3β均在重组质粒ARHI组中高表达,ARHI目的组中cyclin D1的表达比空白对照组中低,且将细胞周期停滞在G1期。负调控凋亡相关蛋白Bcl-2低表达,而凋亡正调控相关蛋白Bax表达相对升高。而AKT在两个组中均无明显表达差异。结论本实验证实了ARHI的表达于结肠癌细胞株和其正常粘膜组织中存在明显不一致,且于后者中高表达,而于前者中表达较低或不表达。根据此结论猜测,ARHI或许参与了结肠癌的产生和生长,并主要扮演拦阻角色。于是构建了ARHI高表达的Ca Co2及SW480结肠癌细胞株。实验证实ARHI过表达可以阻止周期生长,并将其拦阻于G0/G1期,从而阻碍细胞的克隆及增殖能力;经过影响凋亡相关蛋白Bcl-2以及Bax促进结肠恶性肿瘤细胞的凋亡;同时降低其侵袭及迁移能力。我们结果得出ARHI可能通过抑制PI3K/AKT通路,促进下游GSK-3β的表达,从而进一步增强了GSK-3β于cyclin D1的阻碍,以此阻滞了细胞的周期发展;另一方面,ARHI可能经过阻碍PI3K/AKT传导通路,阻碍AKT磷酸化,能高表达下游p53,使Bcl-2表达下降,而Bax则升高,以增加细胞的凋亡率,施展生物学效应。但对于ARHI具体发挥作用位点还需要在进一步的研究中探索。