铝是地壳中含量最丰富的元素之一，大量蓄积可产生神经毒性作用。临床观察长期肾透析的患者脑内铝的蓄积是正常人的15倍，患者最终出现视觉、记忆、注意力和额叶功能的多发性、联合性障碍。国内外流行病学调查和研究表明，铝易致神经元损伤，引起智力和认知能力下降等学习和记忆方面的缺欠。目前动物实验已证实，铝暴露可致大鼠痴呆，其表现为学习和记忆的行为障碍。 海马是学习和记忆的关键脑区，海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)是NMDA受体依赖性突触传递效能的持续性增强，是脑学习和记忆功能在突触水平的研究模型和细胞基础。因此研究铝暴露对LTP及与其突触机制有关的各项生化指标的影响，有助于从突触和蛋白分子水平阐明铝损害脑学习和记忆功能的作用机制。目前虽然铝对LXP损害作用的观察很多，但铝对LTP损害作用的突触机制尚未完全阐明。 母体期和断乳后发育期是脑发育的重要阶段。在此阶段如果遭受了铝暴露，是否会影响其发育，特别是智力和认知能力的发育，这是一个关系到人类健康的重要问题，有关此阶段铝对学习和记忆及LTP影响的报道较少，因此有必要对其进行深入研究。本文拟从母体期和断乳后发育期慢性铝暴露对年轻大鼠的学习和记忆行为、海马LTP和细胞内钙([Ca2+]i)、钙调蛋白依赖性激酶II(CaMK II)的影响的角度，对此问题作以初步探讨，为揭示铝暴露损害脑学习、记忆功能的神经机制提供资料。 材料与方法： 1、动物分组与染毒：健康Wistar大鼠45只，体重250g左右，雌雄2:1。适应饲养环境1w后，随机分为3组：对照组、低剂量组和高剂量组，每组15只(雌雄2:1)。对照组：饮用蒸馏水；低剂量组：饮用含0.2％A1C13的蒸馏水溶液(用0.2％-Al表示)；高剂量组：饮用含0.4％A1C13的蒸馏水溶液(用0.4％-Al表示)。各组自染毒始即分别合笼，子代鼠出生后通过母乳继续染毒，断乳后(生后21天)各组子代鼠对应分别以蒸馏水或母鼠染毒剂量的A1C13溶液喂养，至子鼠生后90天。然后，按原母鼠染毒的剂量分组，每窝取1～2只子鼠(雌雄各半)，组成子代各实验组，以蒸馏水喂养。动物室温度18℃～23℃，相对湿度45～55％。 2、脑组织及血液中铝含量测定：准确称取0.1～0.5g的脑组织或准确吸取0.2～0.5ml的全血于石英烧杯中，加5～8ml混酸，同时做空白对照。采用原子吸收石墨炉法测定脑铝和血铝含量。 3、学习和记忆的行为学测定：测试方法为跳台法(即步下试验，Step-down)。学习行为训练：将大鼠放入跳台仪内适应3min后训练其找到平台三次，大鼠跳下平台时，立即通电给予持续电刺激(36V)并开始计时，记录5min内大鼠受到电刺激第一次跳上平台躲避电击的反应时间(Escape latency,EL)以及受到电击的次数(Number of errors)。24h后进行记忆保持测试：记录大鼠置于平台到第1次跳下平台的时间(Step-down latency,SDL)和5 min内受到电击的次数(错误次数)。 4、电生理LTP测定：乌拉坦麻醉后，将动物头部固定于脑立体定位仪上，在Schaffer侧枝部位(坐标：前囟后3.3mm；旁开3.8 mm；皮层下3.8 mm)插入刺激电极。将记录玻璃微电极插入海马CA1区部位(坐标：前囟后3.3mm；旁开1.5mm；电极尖端先抵皮层表面，然后逐步推进)行细胞外记录。找到稳定的群体锋电位(population spike，PS)后，首先记录30 min，每分钟给予一次单脉冲刺激所诱发的PS。然后观察给予同样强度及波宽的的短串高频条件刺激后，每分钟给予一次单脉冲检验刺激所诱发的PS的幅值变化。 5、海马细胞内游离钙的测定：心脏采血并取脑，分离出海马组织并去除脑膜血管，制备成单细胞悬液，然后Fura-2/AM避光孵育负载，调激发波长340 nm，发射波长510 nm，采用日立F-3000型荧光双波长分光光度计测定。 6、海马钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达：实验后大鼠立即断头取脑分离并取双侧海马组织后按体积比为1：6-1：9放到预冷的裂解缓冲液中。4℃超声粉碎后离心30min，取上清分装。按照常规Western blot方法分离蛋白质。将蛋白印迹显影图扫描，再利用ChemiImager 5500 V 2103图像分析软件对实验结果(测定目标带单位密度)进行分析。 7、统计学处理：实验所得数据资料用-x±S表示，组间资料统计用单因素方差分析(ANOVA)检验，行为学数据不服从正态分布，采用秩和检验。 实验结果： 1、各组大鼠血铝和脑铝含量的比较 随着铝暴露剂量的升高，铝暴露组大鼠的血铝、脑铝含量逐渐升高，且均显著高于对照组(P<0.05 or P<0.01)，且两铝暴露组间差异也显著(P<0.05)。 2、大鼠的学习记忆能力比较 与对照组相比，学习行为表现为第一次跳上平台的时间(反应时间)均明显长(P<0.01)，5 min内受到电击次数显著增多(P<0.01)。记忆行为则表现为第一次跳下平台的潜伏期明显缩短(P<0.01)，5 min内错误次数明显增加(P<0.01)，且两铝暴露组间亦有显著性差异(P<0.01)。 3、PS幅值的变化情况 随着铝暴露剂量的升高，高频刺激后PS幅值增强率依次降低，两铝暴露组与对照组相比，显著降低(P<0.01)，但两暴露组之间差异不显著(P>0.05)。 4、海马神经元的细胞内[Ca2+)i比较 随着铝暴露剂量的增加，海马神经元的细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)逐渐降低。两铝暴露组与对照组相比均降低，0.2％-A1组与对照组的差异具有显著意义(P<0.05)，0.4％-A1组与对照组的差异则具有显著意义(P<0.01)，且0.2％-A1组与0.4％-A1组之间的差异也具有显著意义(P<0.05)。 5、海马CaMKⅡ的表达 与对照组相比，两铝暴露组海马CaMKⅡ的表达明显降低，具有统计学意义(P<0.01)，并且0.2％-A1组和0.4％-A1组之间亦有显著性差异(P<0.01)。 讨论 出生前后(孕期、哺乳期、断乳后发育期)慢性铝暴露的年轻大鼠，与对照组相比其血铝和脑铝含量明显增高，LTP的增强率明显下降，学习行为表现为第一次跳上平台的时间(反应时间)均明显长，5min内受到电击次数显著增多。记忆行为则表现为第一次跳下平台的潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，表明母体的铝暴露可通过胎盘和血脑屏障进入子代鼠体内，造成铝在子代体内蓄积，特别是脑内的蓄积，进而损害了子代鼠的学习和记忆能力。本实验同时观察到，各组海马神经元[Ca2+]i和CaMKⅡ的表达也降低，提示出生前后连续慢性铝暴露年轻大鼠学习记忆能力下降的可能原因之一是铝干扰了海马神经元细胞内Ca2+稳态平衡并进一步抑制了CaMKⅡ的表达。 有研究表明，铝可阻断电压依赖性钙通道(VDCCs)、抑制磷脂酶C(PLC)催化的磷脂酰二磷酸肌醇(PIP2)的水解，造成作为第二信使的三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DG)生成减少，进而影响了Ca2+的内流和内质网钙库中Ca2+的释放。 铝一方面降低了细胞内Ca2+浓度，另一方面铝与钙竞争，抑制了钙与CaM(钙调蛋白)结合性，并使其构型改变，阻断了Ca2+依赖性CaMKⅡ的作用，干扰了磷酸化过程。同时铝对CaMKⅡ参与LTP诱导与维持过程中所需的NMDA受体和AMPA受体等也有影响，因而进一步抑制了CaMK Ⅱ的表达。 综上所述，有理由认为，铝影响学习记忆能力的可能原因之一是其可通过多种途径引起细胞内Ca2+浓度降低，并进一步抑制了CaMKⅡ的表达。 结论： (1)母体期和断乳后发育期慢性铝暴露的大鼠，与对照组相比，PS幅值增强率降低，提示该暴露损害了大鼠LTP的诱导与维持； (2)母体期和断乳后发育期慢性铝暴露的年轻大鼠与对照组相比，学习行为表现为第一次跳上平台的时间(反应时间)均明显延长，5min内受到电击次数显著增多。记忆行为则表现为第一次跳下平台的潜伏期明显缩短，5min内错误次数明显增加，提示铝暴露损害了大鼠的学习和记忆行为； (3)铝损害LTP和对神经元细胞的损伤的可能机制之一是铝造成了海马中的细胞内Ca2+浓度降低； (4)母体期和断乳后发育期慢性铝暴露可使大鼠神经元细胞内CaMKⅡ的表达受到抑制。