恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的主要原因之一,预计到2025年,每年新增确诊肿瘤病例为1930万例。化疗是目前临床上用于肿瘤治疗最常见的方法之一,特别是有转移倾向或已发生转移的肿瘤。由于化疗多通过全身给药的方式实现抗肿瘤治疗,但临床上使用的化疗药物不能有效特异性聚集在肿瘤组织中,不仅降低了其抗肿瘤治疗的效果,而且会对正常组织产生毒性作用,引起心脏毒性、肝毒性、肾毒性等。为了提高化疗药物的疗效,降低对正常组织的影响,构建化疗药物的靶向递送系统,增强其在肿瘤组织中靶向释放的能力,是近年来肿瘤治疗的主要研究方向之一。已有研究证实,脂质载体可作为药物靶向递送载体,其具有独特的优势:(1)脂质是生物细胞膜的主要成分,体内生物相容性高、无免疫原性,且安全无毒。(2)脂质材料能以不共价的形式携载疏水性化疗药物,提高其在水中溶解度。(3)脂质载体上的化疗药物能在体内特定的环境下(如pH、温度、光、超声等)定向释放,且脂质表面进行PEG修饰,能避免吞噬系统的摄取,增加在体内的循环时间,提高化疗药物的稳定性与生物活性。(4)脂质材料易修饰性,可在其表面连接特异性配体构成靶向载体,实现化疗药物的靶向治疗。(5)脂质材料还可以包裹气体构成超声造影剂,显著增强超声显像。脂质超声造影剂不仅已经被广泛用于血栓、肿瘤、炎症等疾病的诊断,还能在超声辐照下定点释放其携载的基因或药物,提高治疗效果。但目前的超声造影剂多为微米级,使其不能穿透肿瘤血管的内皮间隙,实现肿瘤血管外的超声分子显像和近距离靶向递送基因或药物。而相关研究已经证实,脂质纳米泡(nanobubbles,NBs)是一种较常见的纳米级超声造影剂,其稳定性高、穿透能力强,不仅能增强肿瘤血管外超声显像,而且能在超声辐照下近距离向肿瘤实质细胞递送携载的药物或基因。同时在载药或基因纳米泡的表面修饰针对肿瘤组织的特异性抗体或配体,能提高纳米泡在肿瘤血管外组织中的聚集能力,进一步增强血管外超声分子显像效果和靶向治疗效果。CXCR4是一种G蛋白偶联受体,在多种肿瘤细胞上均有高表达,与肿瘤的预后有着密切相关性。CXCR4与特异性配体CXCL12之间相互作用,构成CXCL12/CXCR4轴,促进肿瘤细胞的增殖与侵袭,阻断该轴能抑制肿瘤的生长与转移,因此CXCR4能同时作为肿瘤靶向诊断和治疗的特异性靶点。目前已研发了多种针对CXCR4的靶向药物,其中小分子拮抗剂AMD070已进入临床二期实验,其具有分子量小、渗透性强、水中溶解度大等优点。大量实验证实AMD070不仅能特异性结合CXCR4表达阳性细胞,而且能有效抑制肿瘤细胞增殖和转移。PTX是一种微管稳定剂,已被临床广泛用于宫颈癌、乳腺癌等肿瘤的化疗中,但因其毒副作用较强、水中溶解性差、特异性差等不足,影响了其抗肿瘤治疗疗效。基于此,本项目拟在携载紫杉醇纳米泡上连接CXCR4的小分子拮抗剂AMD070,构建一种具有双重(化学和生物靶向)治疗作用的靶向载药纳米泡(PTX-AMD070 NBs),在体外和体内研究其与乳腺癌和宫颈癌细胞结合、增强超声显像以及靶向释放紫杉醇和AMD070抑制肿瘤生长的过程和机制,为多种肿瘤的超声分子显像和靶向治疗提供一体化的超声造影剂和药物载体。目的1.制备同时携载紫杉醇和CXCR4小分子拮抗剂AMD070的靶向载药纳米泡(PTX-AMD070 NBs),研究其在乳腺癌和宫颈癌中的超声分子显像效果,为肿瘤的靶向超声分子显像提供一种高效、安全、穿透能力强的造影剂。2.探讨PTX-AMD070 NBs联合超声靶向纳米泡破坏技术(ultrasound targeted nanobubble destruction,UTND)治疗乳腺癌和宫颈癌的效果和机制,为靶向载药纳米泡实现多种肿瘤的诊疗一体化奠定详实的实验基础。方法1.PTX-AMD070 NBs用于肿瘤超声分子成像的实验研究(1)采用酰胺反应和机械振荡法制备PTX-AMD070 NBs,检测其粒径、zeta电位、包封率、载药效率和体外琼脂糖模型中的超声显影强度。(2)在体外实验中,利用激光共聚焦显微镜与流式细胞术观察PTX-AMD070 NBs靶向结合CXCR4表达阳性人乳腺癌MCF-7和人宫颈癌C33a细胞的能力。(3)在体内移植瘤中比较PTX-AMD070 NBs和载紫杉醇纳米泡(PTX NBs)的超声增强显像特征。(4)应用免疫组织荧光技术观察PTX-AMD070 NBs在移植瘤组织中的分布和穿透能力。2.PTX-AMD070 NBs联合UTND治疗裸鼠移植瘤的实验研究(1)应用CCK-8和流式细胞术检测PTX-AMD070 NBs联合UTND抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡效果。(2)通过测量裸鼠体重、移植瘤体积、移植瘤质量以及HE染色与TUNEL染色综合评价PTX-AMD070 NBs联合UTND治疗移植瘤的效果。结果1.PTX-AMD070 NBs用于肿瘤超声分子成像的实验研究(1)PTX-AMD070 NBs粒径和zeta电位分别为494.3±61.2nm和-22.4±1.75mV,其包封率和载药量分别为53.73±7.87%和4.48±0.66%。PTX-AMD070 NBs在琼脂糖中的超声显像效果随着其浓度降低而逐渐减弱。(2)PTX-AMD070 NBs与MCF-7和C33a细胞的结合能力明显高于PTX NBs与细胞的结合能力(P<0.05)。(3)体内实验显示,PTX-AMD070 NBs可在裸鼠移植瘤部位特异性聚集,并显著增强超声成像。(4)DiI标记的PTX-AMD070 NBs能够透过MCF-7、C33a和MDA-MB-468移植瘤组织血管内皮间隙进入血管外组织中。而在大腿肌肉血管外的组织间隙中未观察到PTX-AMD070 NBs的分布。2.PTX-AMD070 NBs联合UTND治疗裸鼠移植瘤的实验研究(1)PTX-AMD070 NBs联合UTND组比其他组(Control、AMD070、PTX、AMD070+PTX、PTX-AMD070 NBs)具有更显著的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的效果。(2)与其他组(Control、AMD070、PTX、AMD070+PTX、PTX-AMD070 NBs)相比,PTX-AMD070 NBs联合UTND组中移植瘤的肿瘤体积和质量最小,凋亡和坏死程度最高。结论1.本课题构建的PTX-AMD070 NBs具有粒径小、分散均匀、性质稳定等特点,为其能够运用肿瘤EPR效应进入肿瘤血管外的组织间隙中进行超声分子显像奠定了实验基础。2.在体外实验中,PTX-AMD070 NBs能与CXCR4阳性表达的MCF-7和C33a细胞特异性结合;在体内实验中,PTX-AMD070 NBs能在CXCR4阳性表达的MCF-7和C33a移植瘤中具有特异性增强超声分子显像能力,为肿瘤的靶向诊断提供了一种新的超声造影剂。3.PTX-AMD070 NBs联合UTND技术在体外能够显著增强肿瘤细胞的凋亡率,在体内移植瘤实验中,能够显著抑制肿瘤的生长,并证实这与AMD070的分子靶向性及超声辐照产生的空化效应密切相关,本研究为实现肿瘤靶向诊断和治疗一体化提供了新的研究思路和详实的实验基础。