脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是指由直接或间接外力损伤脊髓，在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍等，是致残、致死率极高的危重性疾病。在当今社会，随着交通事故、矿井灾难、建筑事故及暴力伤害等使得脊髓损伤的人员逐年上升，给社会造成了的巨大的经济负担，患者的生活质量明显下降。虽然对于脊髓损伤的治疗有了很大的进展，但是由于其发病机制并不完全清楚，所以针对脊髓损伤的临床治疗特别是对其运动功能恢复的治疗效果并不十分理想。因此，进一步了解与脊髓损伤病情发展相关的机制及寻求更好更快捷的治疗方法，提高患者的生活质量是我们迫切需要关注的问题。创伤后运动功能下降的机制有很多，目前也取得了很多的进展。近年来，发现创伤后全身应激反应明显，特别是中枢神经系统处于应激状态，保持内环境稳态的自噬在其中发挥着重要的作用。自噬可以通过降解损伤的细胞器及蛋白来维持细胞的稳态，但是其具有双刃剑的作用。众多研究表明，创伤引起的脊髓损伤后自噬是升高的，而且影响脊髓功能的恢复。如果我们能够掌握脊髓损伤过程中自噬表达的时间特征并对其进行有效的调整，可能会对脊髓功能的恢复起到一定的治疗作用，为脊髓损伤的治疗提供新的方向。对于自噬的治疗，我们需要寻找一种抑制自噬，且同时不会对机体造成损伤的方法。近年来发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂在许多神经疾病中具有保护作用。丙戊酸是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，有研究表明，在肿瘤组织中可以抑制自噬，提示这种药物可能对于自噬具有一定的作用，那么这种作用应该会对脊髓损伤的恢复有帮助。本研究从动物实验与细胞研究两个方面开展了相关的工作。研究内容包括以下3个部分:1观察脊髓损伤后脊髓组织自噬的变化特征。2观察丙戊酸治疗脊髓损伤后脊髓组织自噬及运动功能的变化。3选用SH-SY5Y细胞，建立细胞损伤模型，将Beclin-1基因过表达，明确自噬在丙戊酸治疗脊髓损伤中的作用。第一部分大鼠脊髓损伤后脊髓组织自噬的表达特征研究目的建立大鼠脊髓挫伤模型，观察脊髓损伤后不同时间点自噬相关因子Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表达，明确脊髓损伤后自噬表达特征。从而为揭示继发性脊髓损伤的可能机制提供研究条件，并奠定研究基础。研究方法1.实验动物健康雄性Wistar大鼠，体重220~250g，由山西医科大学实验动物中心提供。2.建立大鼠脊髓损伤模型：脊髓损伤模型：应用改良的NYU Impactor (脊髓损伤撞击仪)装置造模法，即用10g重物从25mm的高度落下打击脊髓背侧造成不同程度的损伤，该模型与人类脊髓损伤的性质非常相近，两者均属一定力量撞击后造成脊髓水肿、缺血，并继发一系列损伤反应。以T10为标志，暴露大鼠T9-11椎板，咬除T10的棘突及椎板，调整立体定位仪的立臂将冲击杆对准T10脊髓，将10g重的冲击杆自25mm高度处下落撞击脊髓，冲击杆下落后大鼠迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩扑动，表明撞击成功。冲击杆与脊髓的接触面有轻微的凹槽，以防止损伤脊膜。冲击杆底部直径为2.5mm，略小于脊髓直径，当它压迫脊髓时能够清楚的显示椎管的边缘3. Real-time PCR及Western blot标本采集假手术组术后立即取材，脊髓损伤大鼠术后1h、2h、6h、24h、48h、72h取材，每组分别取6只大鼠，麻醉后取出包含损伤中心长约1cm的脊髓组织，立即置于-80℃冰箱保存，用于提取其总RNA及蛋白。4. Western blot测定LC3和Beclin-1的蛋白含量将脊髓组织匀浆、离心后取上清，用BCA法测定蛋白浓度。配制15%凝胶，上样（上样量LC3及Beclin-1均为40μg/孔）、电泳、转膜（半干式）、封闭、经过一抗、二抗反应后，进行化学发光，利用ImagJ1.44p软件进行条带分析。用目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。5.Real-time PCR测定LC3和Beclin-1的mRNA表达。脊髓组织总RNA提取后，按照说明书将提取的RNA在一定的反应体系及反转录条件下合成cDNA，然后取2ul cDNA与上游引物、下游引物、水及SYBR Premix Ex TaqTM在Mx3005P Real-Time PCR仪上进行扩增，记录Ct值、扩增曲线及溶解曲线。并相对定量结果计算（2-ΔΔCt法）。ΔCt目的基因=Ct实验组目的基因-Ct对照组目的基因ΔCtGAPDH=Ct实验组GAPDH-Ct对照组GAPDH-ΔΔCt=-(ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH)6.免疫荧光染色脊髓损伤后2h，损伤中心冰冻切片进行免疫荧光染色，经过洗片、封闭之后，孵育一抗Anti-LC3和Anti-Beclin-14℃冰箱过夜，洗片后孵育相应的山羊抗小鼠或山羊抗兔的荧光二抗，再次洗片后DAPI染色3min，洗片，封片，激光共聚焦显微镜观察。7.统计处理实验结果以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，使用SPSS15.0统计软件对数据进行统计分析。*P <0.05认为具有统计学意义。结果1脊髓损伤大鼠模型建立成功所有大鼠在术后都得以存活。SCI前、术后2h、术后24h，生理学参数（包括平均动脉血压，PH值，体温，血气分析，血糖）在脊髓损伤组和VPA治疗组没有明显的不同。（见表1）。10g重的冲击杆从自25mm高度处以自由落体落下，金属杆下落后大鼠迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩扑动，表明撞击成功。2脊髓损伤后脊髓组织自噬表达增高大鼠胸椎T10挫伤后，在不同的时间点脊髓组织自噬的表达发生了明显的变化。通过Western blot和Real-time PCR法检测了LC3和Beclin-1的蛋白及mRNA水平的表达。自脊髓损伤后1h开始自噬标记物Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表达就开始增加，在损伤后1h，2h，6h其差异具有统计学意义（*p<0.05），并且其表达水平在损伤后2h达到高峰(**p <0.01)。(见图1-4)3脊髓损伤促进了LC3及Beclin-1的免疫荧光表达脊髓损伤后2h，通过激光共聚焦显微镜观察LC3及Beclin-1的免疫荧光表达情况，结果显示，与假手术（sham组）相比，脊髓损伤后脊髓组织LC3及Beclin-1的蛋白聚点增加，表示其表达增加。小结脊髓损伤后脊髓组织中自噬水平明显增强，通过Real-time PCR、Westernblot、免疫荧光方法，检测到脊髓损伤后1h始其自噬水平开始上升，2h达到高峰。第二部分丙戊酸抑制了大鼠脊髓损伤后脊髓组织自噬的表达并促进了其功能的康复研究目的研究丙戊酸治疗脊髓损伤后脊髓组织自噬水平的变化以及丙戊酸在神经保护及功能康复中的作用。研究方法1丙戊酸治疗脊髓损伤后两组动物随机配对给药和生理盐水，脊髓损伤后立即给予腹腔注射丙戊酸，300mg/kg，Bid。对照组及假手术组给予等量的生理盐水进行腹腔注射。给药周期为2周。2丙戊酸治疗脊髓损伤后LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA水平的测定脊髓损伤后2h，通过Western blot及Real-time PCR法检测脊髓组织LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA水平的变化。3丙戊酸对脊髓损伤大鼠神经保护作用的测定3.1通过Luxol Fast blue对髓鞘进行染色将切片置入95%酒精中5min，0.1%Luxol Fast blue （LFB）溶液中57℃过夜。95%乙醇溶液洗去过多的染液，双蒸水浸洗后，切片置入0.05%的碳酸锂和70%的酒精中反复分化几次，直到灰质和白质分界清楚。评估了跨度4mm的包含损伤中心的9个切片，在显微镜下对其照相×40倍，并用ImageJ1.44p软件定量分析脊髓白质中LFB阳性面积，计算损伤组织切片中LFB阳性面积与正常组织切片总面积的比率。3.2通过尼氏染色对脊髓前角运动神经元进行染色收集包含损伤中心在内的9张切冰冻片，切片放入1:1酒精/氯仿中过夜，然后放入95%酒精中及双蒸水中浸洗，0.1%焦油紫溶液中37℃10min进行染色。然后对切片双蒸水浸洗，95%酒精中分化1min，脱水，透明，封片。奥林巴斯显微镜下对切片照相并对脊髓前角运动神经元进行计数，计数面积为从横切面的一侧经中央管向另一侧画一水平线，对躯体同侧的脊髓前角运动神经元予以计数，并通过Image J1.44p软件进行人工定量。4.丙戊酸对脊髓损伤大鼠行为学影响的评定术后每周行BBB评分，共6周。为保证评分的准确性，由3位非实验人员了解评分标准后，各自评分，取平均值。5.统计处理实验结果以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。使用SPSS15.0统计软件对数据进行统计分析。*P <0.05认为具有统计学意义。结果1丙戊酸促进神经保护及功能的康复1.1丙戊酸减少了大鼠脊髓损伤后脊髓髓鞘的损害脊髓损伤后42天，应用LFB染色评估髓鞘存活情况。与损伤组相比，丙戊酸治疗组脱髓鞘的面积明显的减少了。损伤组和丙戊酸组脊髓组织横切面的总面积都比正常组的总面积小，但是丙戊酸组存活的髓鞘明显多于损伤组。通过定量分析，在距离损伤中心1mm处的头侧，丙戊酸组（30.96%±0.58%）存活的髓鞘面积明显大于损伤组（19.67±0.83%），差异有统计学意义(*p <0.05)。(见图7)1.2丙戊酸增加了大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动神经元的数量脊髓损伤后42天，应用尼氏染色法对脊髓组织冰冻切片进行染色，并计算脊髓前角运动神经元的数目。与损伤组相比，丙戊酸组脊髓前角运动神经元明显增多。尤其是在距损伤中心上、下2mm处，其躯体同侧脊髓前角运动神经元的数量明显增多，差异有统计学意义（*p <0.5）(见图8)1.3丙戊酸促进了大鼠脊髓损伤后运动功能的康复在BBB评分期间，从7天始至42天，丙戊酸组大鼠的BBB评分明显高于对照组。在脊髓损伤后第42天，假手术组其功能正常，损伤组和丙戊酸治疗组其功能均未恢复正常，但丙戊酸组要明显好于损伤组，其BBB评分明显高于损伤组，差异有统计学意义（*p <0.5）。(见图9)2丙戊酸抑制脊髓损伤后脊髓组织自噬的表达2.1丙戊酸抑制了大鼠脊髓损伤后Beclin-1的蛋白水平和mRNA水平的表达脊髓损伤后2h，通过Western blot法和Real-time PCR法，检测脊髓组织中Beclin-1的蛋白和mRNA表达。经过丙戊酸的治疗后，Beclin-1的蛋白水平和mRNA水平表达降低，差异有统计学意义。(*p <0.05)。（见图10,11）2.2丙戊酸抑制了大鼠脊髓损伤后LC3蛋白水平和mRNA水平的表达脊髓损伤后2h，通过Western-blot和Real-time PCR法，检测脊髓组织中LC3II的蛋白和mRNA表达。经过丙戊酸的治疗后，LC3II的蛋白水平和mRNA水平表达降低，差异有统计学意义。(*p <0.05)。（见图12,13）2.3大鼠脊髓损伤后神经元的LC3免疫荧光明显增强为了进一步证实脊髓损伤神经元中自噬的表达，应用免疫荧光技术对NeuN和LC3进行双标染色，通过激光共聚焦显微镜观察到LC3是围绕神经元核的点状荧光，脊髓损伤后围绕神经元核的LC3的点状荧光明显增强，经过丙戊酸治疗的治疗后其LC3的点状荧光较损伤组明显减少。（见图14）小结丙戊酸在治疗脊髓损伤的过程中，抑制了脊髓组织中自噬的表达，并且促进了大鼠脊髓损伤后运动功能的康复，减轻了髓鞘的损害，增加了脊髓前角运动神经元的数量。第三部分自噬在丙戊酸影响SH-SY5Y细胞存活率及轴突生长中的作用研究目的通过建立SH-SY5Y细胞损伤模型来模拟脊髓损伤后神经细胞的变化，并通过基因转染方法上调自噬水平来观察自噬在丙戊酸干预损伤SH-SY5Y细胞中的作用。研究方法1.细胞株SH-SY5Y细胞：购自中科院上海细胞库。2.SH-SY5Y细胞损伤模型的制备细胞接种于96孔培养板中培养24小时，然后加入含不同浓度（50,100,200,300,400μmol/L）过氧化氢的培养基培养SH-SY5Y细胞，使之造成损伤，并用CCK8法检测细胞的存活率。3.丙戊酸干预SH-SY5Y细胞后的存活率、细胞轴突及自噬水平的测定(1)通过CCK8法检测丙戊酸干预SH-SY5Y损伤细胞的存活率；(2)通过倒置显微镜下观察细胞并拍照，应用NIH Image1.55软件对轴突的相对长度进行测量。在6孔培养板每孔细胞瓶中，测定50个神经元并算出其平均值，本实验重复3次。(3)通过Western blot和Real-time PCR法测定丙戊酸干预损伤细胞后自噬相关基因Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表达。4.含Beclin-1目的基因的pcDNA3.l(+)-Beclin-1的质粒载体的构建及鉴定含Beclin-1目的基因的pcDNA3.l(+)-Beclin-1的质粒载体的构建由广州广州生物科技有限公司协助完成。重组质粒的提取，操作步骤按EndoFree PlasmidMini Kit II说明书进行。G418筛选阳性克隆前要做浓度梯度试验确定最佳浓度。细胞转染操作按Invivogen公司的lipofectamine2000转染手册进行。通过Western blot和Real-time PCR法测定细胞转染后自噬相关基因Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表达，来鉴定转染成功。5. Beclin-1过表达后丙戊酸对SH-SY5Y细胞存活率、轴突及自噬水平的测定见本部分研究方法36.统计处理实验结果以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。使用SPSS15.0统计软件对数据进行统计分析。*P <0.05认为具有统计学意义。结果1.细胞损伤模型的建立通过加入不同浓度的过氧化氢至培养液中来观察细胞的存活情况，结果显示随着过氧化氢浓度的增加，细胞的存活率在下降，我们选用存活率下降明显的过氧化氢的浓度（400μmol/L）来为本实验建立细胞损伤模型进行后续实验，此时细胞存活率为41%。（见图15）2.丙戊酸对损伤SH-SY5Y细胞的影响2.1丙戊酸提高了损伤SH-SY5Y细胞的存活率。细胞经过400μmol/L的过氧化氢干预后，经含有1.0mmol/Ld的VPA的完全培养基培养后，细胞的存活率明显的提高。结果显示，与H2O2组相比（54±9），丙戊酸组细胞存活率（77±7）增加了23%，差异有统计学意义（*p <0.05）。（见图16）2.2丙戊酸促进了损伤SH-SY5Y细胞的轴突增长细胞经过400μmol/L的过氧化氢干预后，经含有1.0mmol/L丙戊酸的完全培养基培养后，细胞轴突的生长得到明显提高。结果显示，与H2O2组相比（22±9），丙戊酸组细胞的轴突明显增长（49±8），差异有统计学意义（*p <0.05）。（见图17）2.3丙戊酸抑制了损伤SH-SY5Y细胞自噬的表达通过Real-time PCR及Western blot检测细胞中自噬相关因子Beclin-1和LC3的表达。与正常细胞组相比，经过H2O2处理后，Beclin-1和LC3的蛋白及基因表达水平都明显增高；但是经过含有丙戊酸培养基培养后，与H2O2组相比，其细胞自噬水平被明显抑制，Beclin-1和LC3的蛋白及基因表达水平都明显降低。（见图18-21）3.自噬上调后丙戊酸促进轴突生长和细胞存活率的作用受到抑制。3.1将pcDNA3.l(+)-Beclin-1转染SH-SY5Y细胞后自噬的变化采用western blot法和real-time PCR法检测转染pcDNA3.l(+)-Beclin-1后SH-SY5Y细胞Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表达情况。结果显示，与正常细胞组相比，质粒pcDNA3.l(+)-Beclin-1导入细胞后，其LC3和Beclin-1的蛋白及mRNA水平都明显的降低；而空质粒组其LC3和Beclin-1蛋白及mRNA表达无明显变化。此结果说明细胞转染成功。（见图23-26）3.2自噬上调后丙戊酸提高细胞存活率的作用受到抑制细胞自噬上调后，三组细胞都加入丙戊酸，通过CCK8法检测了细胞的存活率。结果显示，与pcDNA3.l(+)组相比（72±15），pcDNA3.l(+)-Beclin-1组的细胞存活率明显下降（55±11，*P <0.05），差异有统计学意义。（见图27）3.3自噬上调后丙戊酸促进细胞轴突生长的作用受到抑制细胞自噬上调后，通过对轴突的测定，结果显示，与pcDNA3.l(+)组相比（49±12），pcDNA3.l(+)-Beclin-1组的细胞轴突的长度明显下降（27±10，*P <0.05），轴突生长受到抑制，差异有统计学意义。（见图28）小结丙戊酸能够促进损伤SH-SY5Y细胞轴突的生长，提高损伤细胞的存活率并且抑制细胞自噬的表达。通过基因转染技术上调细胞自噬水平后，丙戊酸促进损伤SH-SY5Y细胞轴突生长及提高细胞存活率的作用受到抑制，提示自噬在其中可能发挥着重要的作用。