禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是严重危害养禽业的传染性肿瘤病之一,也是重要的免疫抑制病。禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosisvirus,REV)感染主要造成网状内皮细胞增生,诱发机体免疫抑制和矮小综合征等,同时REV能污染马立克氏病病毒疫苗、禽痘病毒疫苗等生物制品,从而降低疫苗的免疫效果。目前,REV常和马立克氏病病毒、白血病病毒、传染性贫血病病毒、传染性法氏囊病病毒等禽的免疫抑制性病毒混合感染,使疾病的发生更为严重,且有加重趋势。随着我国养殖业的集约化发展,REV感染造成的损失已经严重影响了养禽业的经济效益,所以,有必要对REV感染及致病机制进行深入研究。目前,对REV的研究主要局限在基因组的插入整合、混合感染、疫苗污染等方面,但病毒编码蛋白的功能及其在感染和致病过程中与宿主蛋白之间相互作用等方面的研究鲜有报道,有待于开展。病毒与宿主相互作用在病毒感染过程中发挥重要作用,研究REV与宿主相互作用有助于了解病毒的复制机制。在本实验室的前期研究中,采用蛋白质组学方法并结合双向电泳技术,获得了REV感染SPF鸡的脾脏差异蛋白质数据,经过质谱分析成功鉴定出包括波形蛋白(vimentin)在内的28种差异表达蛋白。研究报道,宿主vimentin在多种病毒的感染过程中发挥重要作用。本研究旨在探讨vimentin在REV感染中的作用。本研究首先利用建立的检测vimentin基因的Real time PCR方法检测vimentin基因在不同组织脏器中的分布,结果表明vimentin蛋白广泛表达于所检测的各组织脏器中,其中胸腺、法氏囊和脾脏含量最高。同时检测发现,REV感染后导致易感细胞CEF和主要靶器官脾脏中vimentin上调表达。利用靶向vimentin蛋白的特异性RNAi分子沉默CEF细胞内源性vimentin蛋白的表达,可抑制REV基因组的复制、蛋白的表达以及REV的增殖。利用能特异性破坏vimentin蛋白结构的药物丙烯酰胺处理REV易感细胞CEF,同样可抑制REV基因组的复制、蛋白的表达以及REV的增殖。这说明,宿主细胞vimentin有利于REV的复制。为进一步探索宿主vimentin影响REV复制的机制,本研究首先通过密码子优化和蛋白表达条件的优化,对REV蛋白酶(protease,PR)进行了可溶性表达。以表达的REV自身蛋白p18-p30为底物,对其酶活性进行分析,结果显示可溶性表达的PR蛋白具有良好的蛋白酶活性,能有效切割底物p18-p30,并且PR活性的发挥受温度、p H值、离子等因素的影响。进一步研究发现PR蛋白对原核和真核表达的vimentin蛋白均具有切割作用,将PR蛋白截短表达以及将其活性中心DTG基序突变为DSG后,结果显示PR均不能有效切割vimentin,这表明PR的这种切割作用依赖于其蛋白分子结构和活性中心DTG基序。将表达PR蛋白的真核表达质粒p CAGGS-PR转染细胞,真核表达的PR蛋白对细胞内源性vimentin蛋白同样具有切割作用。激光共聚焦试验结果显示,真核表达PR蛋白能够导致细胞中的vimentin在细胞核周围发生聚集,同样的REV感染后也能改变vimentin在宿主细胞内的分布,在细胞核周围发生聚集,且与REV结构蛋白共定位。综上,REV感染导致宿主vimentin上调表达;宿主vimentin有利于REV的复制;REV PR在体内外具有切割宿主vimentin的作用,而且这种切割作用依赖于PR蛋白的分子结构和活性中心DTG基序;REV感染后通过PR与宿主的互作而改变vimentin在宿主细胞内的分布,在细胞核周围发生聚集,且与病毒蛋白共定位,这可能有利于病毒蛋白的聚集和病毒“复制工厂”的建立,这是vimentin参与REV感染和复制的分子机制之一。