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研究背景与目的脓毒症(sepsis)被定义为感染(可疑或证实)引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),其本质是炎症介质介导的宿主自身免疫损伤。脓毒症是儿童重症监护病房(pediatric intensive care unit, PICU)最常见的危重病之一,其发病率和死亡率高。脓毒症病情进展迅速,进一步发展常可导致严重脓毒症、感染性休克和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction, MODS)。严重脓毒症、感染性休克和多器官功能障碍综合征由于微循环衰竭和线粒体功能障碍常可影响各个器官组织,心脏是易受损伤的靶器官之一。脓毒症心肌功能障碍在临床上很常见,其特征包括心肌收缩功能损害、可逆性的心脏扩大、心室射血分数下降和对血管活性药物的反应下降等。文献报道,脓毒症患者中约有40%可发生可逆性的心肌抑制,7%的患者出现严重心功能障碍。合并心功能障碍的脓毒症患者比没有合并心功能障碍脓毒症患者死亡率高50%。脓毒症心肌功能障碍如此高的死亡率,是因为其发病机制十分复杂。目前研究发现免疫系统激活、氧化应激反应、炎症因子损伤、细胞凋亡、Toll样受体作用、肾上腺素信号异常和心肌线粒体功能障碍等多种机制参与其中,然而对于脓毒症心功能障碍的确切发病机制尚未完全研究清楚。近年来,越来越多的研究发现炎症因子损伤、线粒体活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生过多和氧化应激损伤在脓毒症心功能障碍的发病机制中起着重要作用。目前对于脓毒症心肌损伤尚无特效治疗药物。临床研究发现胰岛素强化治疗严格控制脓毒症患者的血糖水平,可显著降低患者死亡率,此外还发现胰岛素强化治疗可有效改善脓毒症患者心肌抑制及促进心功能的恢复。胰岛素是一种由胰岛p细胞分泌的蛋白质激素,其主要生理作用是调节机体代谢过程。胰岛素可以促进各组织细胞对葡萄糖的摄取和利用,促进糖原合成,抑制糖原的分解和糖异生,降低血糖；胰岛素还可促进脂肪酸的合成和贮存,使脂肪分解减少；胰岛素可促进机体对氨基酸的利用和增加蛋白质合成。近年研究表明,胰岛素除降血糖作用外,还具有抗炎、减少氧化应激反应和免疫调节等作用,但其具体机制并不十分明确。目前有研究发现胰岛素可能上调解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)的表达,减少ROS的产生,对抗氧化应激损伤发挥保护作用。解偶联蛋白2是定位于线粒体内膜上的一种阴离子质子转运蛋白,可参与线粒体氧化磷酸化反应和三磷酸腺苷合成解偶联的过程,可以调控细胞能量的生成、调控细胞内炎症反应、抑制ROS的产生、维持线粒体膜电位稳定、维持线粒体膜内外钙平衡和调节线粒体的再生修复等。最近研究发现脂多糖诱导脓毒症模型大鼠心肌组织UCP2表达上调,推测UCP2可能与脓毒症心肌损伤有关。此外,有研究通过沉默H9C2心肌细胞UCP2基因的表达后,发现心肌细胞线粒体损伤加重,炎症因子水平升高和ROS产生增加,提示UCP2可能通过调控细胞炎症反应和氧化应激反应,对心肌细胞起保护作用。然而,胰岛素对脓毒症心肌细胞损伤的保护作用以及UCP2在其中可能的作用,目前研究较少。因此,我们推测胰岛素可能通过调节UCP2的表达,调控细胞内炎症反应和氧化应激反应,从而减轻心肌损伤发挥保护作用。内毒素即脂多糖(LPS),是革兰阴性细菌细胞壁的一种主要成分,常用于脓毒症细胞模型的研究。因此,本实验以H9c2心肌细胞为研究对象,通过LPS诱导的H9c2心肌细胞损伤模拟脓毒症心肌损伤模型,观察胰岛素对脓毒症心肌损伤的保护作用以及UCP2可能的作用,探讨胰岛素对其表达的影响,从而证实胰岛素的多重作用,并为胰岛素在临床脓毒症患者中的应用提供理论依据。方法1.建立H9C2心肌细胞损伤模型及分组把H9C2心肌细胞正常培养24h后随机分为对照组(CON组)、LPS刺激组(LPS组)、LPS+70IU/L胰岛素组(IN 70 IU/L组)、LPS+350 IU/L胰岛素组(IN 350 IU/L组)和LPS+700IU/L胰岛素组(IN 700 IU/L组)5组,胰岛素处理组于LPS刺激前15min加入相应剂量胰岛素,对照组加入与LPS等量的生理盐水。然后LPS组和胰岛素处理组都接受脂多糖处理2411。上述LPS组和胰岛素处理组中LPS的终浓度为1ug/ml o2.检测标本的收集和检测2.1检测标本的收集处理结束后收集各组细胞培养液标本和细胞标本,细胞培养液标本适当分装后放在-80℃保存备用,细胞标本收集后立刻进行蛋白提取或RNA提取。2.2乳酸脱氢酶(LDH)及心肌细胞活力检测按照LDH和细胞活力检测试剂盒说明书进行操作。2.3丙二醛(MDA)水平及总超氧化物歧化酶(SOD)活力检测按照MDA和SOD检测试剂盒说明书进行。通过BCA法检测细胞蛋白浓度,按照说明书要求加入反应液后反应,酶标仪上测OD值,根据说明书公式计算结果。2.4活性氧(ROS)水平的检测按照说明书要求通过比色法检测细胞内活性氧(ROS)水平2.5肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β (IL-1β)水平检测按照说明书要求,运用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测培养液TNF-α和IL-1p水平2.6 UCP2mRNA表达检测通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测UCP2mRNA水平。按照Takara公司试剂盒进行细胞RNA提取、逆转录及PCR反应。以β-actin作为内参基因,计算UCP2mRNA相对表达水平。2.7 UCP2蛋白表达检测通过蛋白提取试剂盒提取心肌细胞蛋白,用BCA法测定细胞蛋白浓度。运用蛋白免疫印迹法检测UCP2蛋白表达。以P-actin作为内参蛋白,比较各条带的灰度值,分析UCP2蛋白表达水平。3.统计学分析所有数据使用IBM SPSS20.0统计软件分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示统计结果。多样本间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐时两组均数比较采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett T3法。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.各组H9C2心肌细胞培养液LDH酶水平比较与对照组比较,LPS组LDH水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。而与LPS组比较,IN350 IU/L和IN 700 IU/L两组的LDH水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与IN 70IU/L及IN 700IU/L组比较,350 IU/L组的LDH水平更低。2.各组H9C2心肌细胞细胞活力比较与对照组比较,LPS组细胞活力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。而与LPS组比较,IN 350 IU/L和IN700 IU/L两组的细胞活力升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与IN 70IU/L及IN 700IU/L组比较,350 IU/L组的细胞活力更高。3.各组H9C2心肌细胞MDA含量比较与对照组比较,LPS组心肌细胞中MDA含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,350IU/L和700IU/L两种剂量的胰岛素处理能够明显降低心肌细胞中MDA含量,差异有统计学意义(P<0.05)。与N 70 IU/L组及N 700 IU/L组比较,IN 350IU/L组的MDA含量更低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.各组心肌细胞SOD活力比较与对照组比较,LPS组心肌细胞中SOD活力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,350IU/L和700IU/L两种剂量的胰岛素处理能够明显升高细胞中SOD活力,差异有统计学意义(P<0.05)。与IN 70IU/L组及IN700 IU/L组比较,IN 350IU/L组的SOD活力更高,差异有统计学意义(P<0.05)。5.各组心肌细胞ROS水平比较与对照组比较,LPS组心肌细胞中ROS水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,350IU/L和700IU/L两种剂量的胰岛素处理能够明显降低心肌细胞中ROS水平,差异有统计学意义(P<0.05)。与IN70 IU/L组及IN 700IU/L组比较,IN 350IU/L组的ROS水平更低。6.各组H9C2心肌细胞培养液TNF-α水平比较与对照组比较,LPS组TNF-α水平显著增加,差异有统计学意义,(P<0.05)。而与LPS组比较,IN 350 IU/L和IN 700 IU/L两组的TNF-α水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与700 IU/L组比较,350 IU/L组的TNF-α水平更低。7.各组H9C2心肌细胞培养液IL-1β水平比较与对照组比较,LPS组IL-1β水平增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,胰岛素处理能稍降低IL-1β水平,但差异无统计学意义(P>0.05)。8.各组H9C2心肌细胞中UCP2mRNA表达变化与对照组比较,LPS组心肌细胞内UCP2mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,IN 350 IU/L和IN 700 IU/L两组细胞的UCP2mRNA表达均有升高,差异有统计学意义(P<0.05)。以IN 350IU/L胰岛素作用较好(P<0.05)。9.各组H9C2心肌细胞中UCP2蛋白表达变化与对照组比较,LPS组心肌细胞内UCP2蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,IN 350 IU/L和IN 700 IU/L两组细胞的UCP2蛋白表达均有升高,差异有统计学意义(P<0.05)。以IN 350IU/L胰岛素作用较好(P<0.05)。结论1.LPS可以损伤正常培养的H9C2心肌细胞；2.胰岛素可降低LPS诱导的H9C2心肌细胞损伤,可能是通过上调受损心肌细胞内UCP2的表达、进而减轻炎症反应和氧化应激反应,从而发挥细胞保护作用；