皮肤是人体最大器官,其正常胚胎发育以及成体自我更新对于形成人体与外界环境之间的屏障非常重要。皮肤发育和自我更新是一个复杂的生物学过程,经历了角质形成细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学事件,彼此处于动态平衡,受到多信号转导途径精细而复杂的调节,但迄今关于皮肤发育的分子信号机制远未阐明。Cdc42是小G蛋白Rho家族蛋白中的重要成员,体内的Cdc42有两种形式,即GDP结合的无活性状态与GTP结合的活性状态。Cdc42在细胞信号转导通路中具有分子开关作用。活化的Cdc42通过作用于细胞内一系列下游效应底物来影响细胞的生长、分化、凋亡和细胞周期等一系列重要生命现象,其最重要的功能是调节肌动蛋白细胞骨架重组。近期研究发现,小G蛋白Rho家族对角质形成细胞的增殖、分化和凋亡具有重要调控作用。本课题组前期研究揭示RhoA可以通过MEKK1/JNK信号通路调控角质形成细胞的增殖与分化,促进皮肤创伤愈合。但是,关于Cdc42在皮肤发育与自我更新中的作用鲜有报道。近期课题组成功建立表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠,结果出人意料的是小鼠于出生后24h内发生死亡。提示Cdc42在皮肤发育过程中发挥着重要作用。本课题拟运用转基因小鼠模型,探讨Cdc42在皮肤发育的作用及其可能作用机制,进而探索皮肤发育的复杂信号机制,从而为研究和治疗各种皮肤病奠定坚实的理论基础。一、表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠模型的建立(一)目的 为载体水平研究Cdc42基因在皮肤发育中的作用提供有效研究工具。(二)方法利用Cre/loxP重组酶系统,将Cdc42loxp/loxp小鼠和K14-Cre转基因小鼠进行杂交,培育出Cdc42基因半敲除小鼠,基因型为Cdc42loxp/+/K 14-Cre(+)。而后利用Cdc42loxp/+/K 14-Cre(+)小鼠与Cdc42loxp/loxp小鼠杂交,其后代获取1/4比例Cdc42基因全敲除小鼠,简称KO小鼠,基因型为Cdc42loxp/loxp/K14-Cre(+);获取1/2比例Cdc42基因未敲除小鼠,简称WT小鼠,基因型为Cdc42loxp/+/K14-Cre(-)或Cdc42loxp/loxp/K14-Cre(-).通过PCR方法和Cdc42免疫组织化学方法进行基因鉴定。按照准确的日龄取E14.5-E18.5天的鼠胚和出生乳鼠P1。将鼠胚或乳鼠放入4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片和染色。(三)结果1.经PCR基因鉴定,K14-Cre(+)可见496bp和200bp两条特异条带,Cdc42loxP/loxP可见465bp一条特异性条带。K14-Cre(+)且Cdc42loxP/loxP的小鼠为KO小鼠。2.通过免疫组织化学方法进行基因鉴定,KO小鼠于E15.5仅在表皮基底细胞尚有Cdc42表达,随着胚胎的发育,基底细胞Cdc42表达逐渐减弱,出生后基底细胞Cdc42表达几乎完全消失。结果证明,随着胚胎的发育,KO小鼠表皮Cdc42基因被有效敲除。3.KO小鼠于出生后24h内发生死亡。与WT小鼠比较,E17.5-P1的KO小鼠体型矮小,且体重差异具有统计学意义。KO乳鼠皮肤表型异常,皮肤潮红光亮,似绸缎。(四)结论成功建立表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠。二、转基因小鼠重要内脏器官的组织形态学观察(一)目的判断Cdc42基因敲除是否影响了重要内脏器官的发育而导致KO小鼠的死亡。(二)方法通过HE染色观察KO小鼠肝脏、肾脏、肺和心脏在发育过程中的组织形态学变化；应用PAS染色观察KO小鼠在肝脏发育过程中肝细胞糖原的合成情况。(三)结果除了出生后肝脏、肾脏、肺和心脏出现淤血现象,实质细胞发生水肿变性外,KO小鼠的肝脏、肾脏和肺在发育过程中未见明显组织结构异常。KO小鼠在肝脏发育过程中未见肝细胞糖原合成异常。(四)结论Cdc42基因敲除没有干预小鼠重要内脏器官的发育。三、Cdc42基因敲除对小鼠皮肤发育的影响及其作用机制(一)目的探讨Cdc42基因敲除对小鼠皮肤发育的影响及其可能作用机制。(二)方法利用皮肤通透性分析和脱水测试分析,检测KO乳鼠皮肤屏障功能。通过HE染色和PAS染色,对KO小鼠腹部皮肤的组织形态学结构进行动态观察；通过扫描电镜和透射电镜观察KO乳鼠皮肤超微结构变化。通过免疫组织化学法检测K19、K15、K14、K1、K6、Loricrin 和 Involucrin的表达,研究Cdc42基因敲除对表皮干细胞的影响及其对角质形成细胞分化的影响。通过BrdU染色和TUNEL法检测Cdc42基因敲除对皮肤发育过程中表皮角质形成细胞增殖和凋亡的影响。通过免疫组织化学荧光法检钡β-catenin、E-Cadherin、 Desmoplakin、ZO-1和a6-intergrin的表达,观察KO小鼠皮肤发育过程中角质形成细胞连接的变化。通过免疫组织化学法检测p-ERK、p-JNK、p-p38和p-c-Jun的表达,研究Cdc42在小鼠皮肤发育中的作用机制。(三)结果1.KO小鼠表皮屏障功能破坏：经皮肤通透性分析,KO小鼠与WT小鼠相似,生物素染料未渗入表皮角质层下方,但KO小鼠角质层染色明显加深；经脱水检测分析,WT小鼠在KO小鼠生存时间内体重仅下降约1.5%,而KO小鼠体重下降约5%,证实KO小鼠存在严重脱水现象。2.KO小鼠表皮组织结构异常：HE染色结果显示,Cdc42基因敲除造成表皮组织结构异常。E15.5,KO小鼠表皮开始出现异常,没有明显表皮嵴状突起形成,皮肤表面平坦。P1,KO小鼠表皮轻度增厚；局部基底细胞与棘细胞之间以及相邻棘细胞之间的间隙增宽,棘细胞皱缩,细胞间桥拉长,清晰可见；局部表皮基底细胞排列不整齐,细胞形态不规则；WT小鼠角质层较疏松,呈剥脱状,而KO小鼠表皮角质层较致密。PAS染色结果显示,KO小鼠皮肤发育过程中,表皮细胞糖原分布和含量未见明显异常。扫描电镜结果显示,E17.5,WT小鼠皮肤表面有明显的隆起和深沟,隆起饱满,表面均匀分布着小颗粒状凸起,有少量裂隙；而KO小鼠皮肤表面隆起不饱满,明显塌陷,皮肤表面有大量裂隙,小颗粒状突起数量少且不明显。P1:WT小鼠皮肤表面表面凹凸不平,呈明显的波浪状；表面有许多规则的小的圆丘状隆起；而KO小鼠皮肤表面较为平坦；表面的圆丘状隆起较大且数量少,部分泡状隆起有剥脱现象。透射电镜结果显示,KO乳鼠表皮基底细胞与棘细胞之间以及棘细胞之间的细胞间隙增宽,细胞间桥拉长,但数量未见明显减少；部分基底细胞和棘细胞胞体皱缩,棘细胞较扁平。3.KO小鼠囊间表皮角质形成细胞增殖增加、凋亡减少：BrdU检测结果显示,E15.5～E18.5,WT小鼠和KO小鼠BrdU阳性细胞都主要分布在囊间表皮基底层。随着胚胎的发育,两者BrdU阳性细胞数量均呈下降趋势。不同点是KO小鼠BrdU阳性细胞数量均比同龄WT小鼠显著增多(P<0.05)。TUNEL法检测结果显示,WT小鼠和KO小鼠囊间表皮角质形成细胞均于E17.5开始出现凋亡现象,且随着发育,二者囊间表皮凋亡细胞数量均呈增加趋势,但与WT小鼠比较,KO小鼠囊间表皮凋亡细胞的数量以及分布部位均发生改变。KO小鼠囊间表皮阳性细胞数量明显少于WT小鼠。WT小鼠阳性细胞分布于颗粒层和整个棘层,甚至基底层,而KO小鼠仅分布在颗粒层和棘层浅部。4.KO小鼠囊间表皮基底细胞可以终末分化,但其分化形式发生改变：本实验对E15.5、E17.5和P1三天鼠龄小鼠表皮细胞进行分化指标K14、K6、K1、Loricrin和Incolucrin的检测。K14主要表达于基底层细胞,是基底细胞有丝分裂活跃的标志蛋白。K1主要表达于基底层上方的表皮细胞,是表皮角质形成细胞终末分化的标记。Loricrin和Incolucrin表达于颗粒层,是表皮角质形成细胞已完成终末分化并正在进行角化过程中的标志性蛋白。K6是一种过渡增殖相关角蛋白,是由处于快速增殖状态的角质形成细胞表达,正常情况下囊间表皮细胞不表达K6。K14表达结果显示WT小鼠K14都表达于囊间表皮基底层细胞和表皮嵴深部的棘细胞,而KO小鼠K14表达范围明显增大,囊间表皮基底层细胞和棘层细胞均有表达。K6表达结果显示WT小鼠囊间表皮细胞不表达K6,而KO小鼠囊间表皮细胞于E17.5在近基底层的棘细胞可见散在细胞表达K6,于P1天所有棘细胞均显著表达K6。K14表达范围扩大和K6异位表达说明Cdc42基因敲除改变了角质形成细胞的正常分化形式。K14和K6二者均是与细胞有丝分裂活跃有关的角蛋白。KO小鼠表皮角质形成细胞K6和K14的异常过渡表达也说明Cdc42基因敲除可以引起角质形成细胞增殖能力增强。该实验结果与BrdU检测结果一致。K1、Loricrin和Involucrin免疫组化检测结果显示KO小鼠表皮细胞在蛋白表达部位和表达量方面未见明显异常,说明Cdc42基因敲除虽然影响了角质形成细胞的分化形式,但对角质形成细胞的终末分化却没有明显影响。5.KO小鼠囊间表皮干细胞数量减少：K19和K15是表皮干细胞的标志。K19和K15表达结果显示KO小鼠与WT小鼠囊间表皮K19和K15表达部位相同,均表达于基底层,但KO小鼠K19和K15阳性表达细胞数量和表达强度均较同龄WT小鼠明显下降。说明Cdc42基因敲除导致囊间表皮干细胞数量减少。6.KO小鼠表皮角质形成细胞间紧密连接和中间连接发生破坏：本实验对E15.5、E17.5和P1三天鼠龄小鼠表皮细胞进行不同细胞连接相关结构蛋白进行检测。ZO-1是紧密连接结构蛋白,检测结果显示WT小鼠和KO小鼠表皮细胞ZO-1均表达于基底层细胞和基底层上各层细胞的胞膜部位。WT小鼠E15.5和E17.5天比P1天的ZO-1表达强,以E17.5 ZO-1表达最强。KO小鼠ZO-1表达均比同龄WT小鼠明显减弱。结果说明Cdc42基因敲除引起了角质形成细胞间紧密连接的破坏。E-Cadherin和β-catenin是中间连接结构蛋白。E-Cadherin表达结果显示WT小鼠和KO小鼠表皮E-Cadherin均表达于囊间表皮基底细胞的侧面和顶面以及基底层上各层细胞的胞膜部位。与WT小鼠比较,KO小鼠表皮E-Cadherin表达出现异常。E17.5,KO小鼠表皮细胞E-Cadherin表达明显增强,表皮基底层细胞和基底层上细胞均强表达E-Cadherin;P1,KO小鼠表皮细胞E-Cadherin表达却发生减弱。WT小鼠和KO小鼠表皮角质形成细胞β-catenin表达与E-Cadherin表达一致。结果说明Cdc42基因敲除引起了角质形成细胞间中间连接的破坏。Desmoplakin是桥粒结构蛋白,a6-intergrin是半桥粒结构蛋白。免疫组化结果显示WT小鼠和KO小鼠表皮Desmoplakin和a6-intergrin表达未见明显异常。结果说Cdc42基因敲除对桥粒和半桥粒没有明显影响。7. p-JNK、p-p38、p-ERK和p-c-Jun的表达结果：KO小鼠和WT小鼠表皮细胞p-p38和p-JNK表达结果一致。结果显示E15.5、E17.5和P1三天鼠龄的KO小鼠和WT小鼠表皮各层角质形成细胞均表达p-p38和p-JNK,未见显著差异。p-ERK表达结果显示皮肤发育过程中,WT小鼠角质形成细胞p-ERK的表达呈动态变化：E15.5和E16.5, p-ERK强表达在基底层上细胞；E17.5,p-ERK表达明显减弱；P1,p-ERK未见阳性表达。与WT小鼠比较,KO小鼠仅在E16.5有少量散在的基底层上细胞表达p-ERK,其余时间均未见阳性表达。p-c-Jun表达结果显示皮肤发育过程中,WT小鼠角质形成细胞p-c-Jun表达呈动态变化：E15.5,表皮各层可见散在阳性细胞分布；E17.5,表皮阳性细胞数量明显增多,其中颗粒层阳性表达强；P1,表皮阳性细胞数量显著减少,仅在颗粒层有极少量分布。与WT小鼠比较,E15.5,KO小鼠表皮p-c-Jun表达未见明显差异；E17.5,KO小鼠表皮阳性细胞主要分布在棘层浅层和颗粒层,其阳性细胞数比WT小鼠明显减少；P1,KO小鼠表皮阳性细胞也分布在颗粒层,但其阳性细胞数比WT小鼠增多。(四)结论1.Cdc42对维持表皮角质形成细胞间紧密连接和中间连接具有重要作用。2.Cdc42基因敲除引起囊间表皮干细胞数量减少,破坏表皮自我更新。3.Cdc42基因敲除对表皮角质形成细胞凋亡具有抑制作用。4.Cdc42可能通过ERK/MAPK信号通路调节小鼠表皮角质形成细胞的生物学功能。