液体活检是以患者的体液作为肿瘤活检样本的一类非侵入性诊断方式。外泌体源性microRNAs作为液体活检中的重要组成部分,在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药中发挥着重要作用。相对于体液中游离的microRNAs,外泌体源性microRNAs在血清中的数量与稳定性方面具有独特的优势,且外泌体源性microRNAs是通过特定分拣机制整合入外泌体中的,这种机制的存在使得外泌体中的microRNAs能够更特异地反映肿瘤细胞的基因特性。大量证据表明,外泌体源性的microRNAs与乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌等多种癌症的发生发展有关,癌组织中外泌体衍生的microRNAs水平异常升高,因此外泌体源性的microRNAs是肿瘤早期诊断、疗效监测和预后评估的潜在生物标记物。然而,仍有一些技术和生物学上的局限性阻碍了外泌体源性microRNAs的临床检测。逆转录PCR(RT-PCR)是临床应用最广泛的方法,但是该方法对加样环境和人员要求较高,容易造成孔间交叉污染,且若样品中microRNAs逆转录水平低或含有抑制性物质,也会导致假阴性结果产生。生物传感器是一类多种学科交叉的高新技术,它集高效与小巧于一身,操作简便,成本低廉,对实验设备与操作人员无特殊要求,近年来已被广泛运用于临床核酸和蛋白检测,甚至用于研发军事战地诊断装备。其中电化学生物传感器是一类通过固定在电极表面的生物分子识别元件将待测靶标的浓度转化为可测电信号的具有经济、快速、简便等特点的新型传感技术,近年来已经成为了研究者们探究的热点。由于电化学生物传感器更适用于低浓度、复杂生物体系的分子检测,因此目前已被广泛应用于临床核酸及蛋白检验、食品安全检测和环境监测等领域。本研究的目的是构建一个用于外泌体源性microRNAs检测的高特异性、高灵敏度、操作简便的电化学生物传感器。方法是利用锁核酸修饰的链置换反应捕获目标序列microRNA-21,再通过G四联体/滚环扩增(RCA)信号放大策略,我们实现了外泌体源性microRNAs的高特异性、高灵敏度的电化学生物传感,并初步探索该传感器应用于临床的准确性。论文内容主要包括一下几个部分:第一章前言简要介绍了外泌体源性microRNAs检测的重要临床意义以及方法学现状;并介绍了生物传感器的优点和应用进展,着重论述了电化学生物传感器的优点以及应用;阐述了本论文的研究目标。第二章基于链置换触发G四联体/RCA信号放大策略的电化学生物传感器的构建极其在外泌体源性microRNAs检测中的初步应用近年来,为了实现痕量microRNAs的检测,研究者们构建了基于各种信号放大策略的生物传感器。其中,RCA是一种新型的恒温线性核酸扩增技术,该技术由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点,近年来得到了不断的发展。另外,G四联体作为应用最广泛的DNA酶,它能够与亚甲蓝通过π-π末端堆积更加高效的结合,从而达到更理想的信号放大效果以及更灵敏的检测目的,常被用于构建电化学生物传感器。此外,位点介导的链置换反应(TMSDR)是一种由较短的悬垂单链区域启动的,能够在恒定的温度和位移条件下高效地完成对目标序列特异性识别的反应,其作为一种特异的识别策略已被广泛应用于各种生物传感器的构建中。同时,锁核酸(LNA)能显著提高碱基错配序列与互补双链之间的解链温度(Tm)差异,进一步提高识别系统的特异性和准确性。锁核酸协同TMSDR辅助的磁珠分离技术将有助于外泌体源性microRNAs的特异性检测。基于此,我们构建了基于链置换触发的G四联体/RCA信号放大策略的电化学生物传感器用于外泌体源性microRNAs的检测。在目标序列外泌体源性microRNA-21存在下,锁核酸修饰的TMSDR将会被启动,目标序列将功能探针P2替换下来,P2通过其一端与富含C碱基的RCA模板结合,触发RCA反应。富含G碱基的RCA产物可以与金电极上的ssDNA探针结合,在K+的参与下进一步折叠成G四联体。最后将电化学信号指示剂亚甲基蓝高效地嵌入G四联体结构中获得电化学信号,成功地实现外泌体源性microRNAs的超灵敏生物传感。基于该信号放大策略,此电化学生物传感器峰电流强度增加值与microRNA-21浓度的增加值在10 fM～10 nM的范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.9972,且其检测限低至2.75 fM。此外,与RT-PCR相比,我们所构建的生物传感器具有良好的重复性、稳定性和高一致性。因此,本研究有望为癌症的早期无创诊断和预后评估提供一种简便有效的策略。