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肠道病毒D68(Enterovirus D68,EVD68)属于小RNA病毒科肠道病毒属D种,该病毒按进化情况可划分3个主要基因型:A(A1-A2),B(B1-B3)和C以及原型株Fermon毒株。2014年以来EVD68在全球多地暴发并引起一系列与呼吸系统相关的疾病,包括支气管炎、肺炎、呼吸衰竭,甚至死亡。同时有文献报道感染EVD68 B1/B3亚基因型病毒与急性弛缓性脊髓炎发作有因果关联。到目前为止尚无有效的治疗药物以及预防性疫苗上市,EVD68在目前以及将来仍会是公共卫生的一大威胁。开发EVD68尤其是覆盖EVD68 B基因型的疫苗会极大减少病毒感染造成的财政负担以及患者痛苦。在实验室的前期工作中,我们已经开发了针对EVD68-US/MO/14-18947毒株(简称18947毒株)的灭活疫苗以及针对EVD68-US/MO/14-18950毒株(简称18950毒株)的病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)疫苗。本实验在实验室前期基础上旨在开发一种能够广谱覆盖EVD68 B基因型流行株的VLP疫苗。我们首先以EVD68 B基因型P 1结构蛋白序列为主体,参考EVD68 A和C基因型毒株以及Fermon毒株的P1蛋白序列,选取共有序列(Consensus Sequence)设计了EVD68 Consensus P1序列并绘制进化树比较其与多株EVD68病毒P1序列之间的进化差异。然后Consensus P1序列和18947毒株P1结构蛋白序列一同使用“P1+3CD蛋白酶”策略分别在毕赤酵母中表达,经过Western Blot,SDSPAGE以及负染电镜观察确认两种P1结构蛋白均能够在毕赤酵母系统表达,随后被有效切割成VP0、VP1,VP3并自发组装成病毒样颗粒(简称为Consensus VLP/18947 VLP)。毕赤酵母表达的Consensus VLP能够在小鼠中激发抗体反应,其抗血清对18947VLP、ConsensusVLP都具有很好的结合能力。同时,抗血清对于EVD68B1亚基因型18947株病毒具有高水平的中和滴度,对A基因型US/KY/14-18953株病毒(简称18953毒株)、Fermon株具有低水平的中和反应。毕赤酵母表达的18947 VLP具有良好的免疫原性与抗原性,能够在小鼠中激发出抗体反应,抗血清能够结合18947 VLP抗原。同时,抗血清能够对EVD68 B1亚基因型18947株病毒产生较高水平中和反应以及对A基因型18953株病毒产生高水平中和反应,但对Fermon原型株仅有低水平的中和反应。本实验证明两种VLP是具有良好的免疫原性与抗原性,为下一步开发供临床使用的EVD68 B基因型广谱疫苗提供了依据。