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背景及目的:隐球菌性脑膜炎是一种严重的致死性感染性疾病,其发病率及死亡率极高,而快速和准确的诊断有助于更好的预后。目前临床常用的诊断方法(如脑脊液墨汁染色、真菌培养、乳胶凝集试验等)都具有自身的局限性,而随着新一代测序平台的发展,转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)扩增子测序技术可以相对无偏移、快速、灵敏地检测体液中的主要病原体,可作为诊断颅内真菌感染的补充手段。本研究探讨ITS扩增子测序诊断隐球菌性脑膜炎及病原体隐球菌菌种分析的可行性。方法:从11例临床诊断隐球菌性脑膜炎患者和4例非颅内感染性疾病患者中采集脑脊液标本并提取其全部DNA,使用转录间隔区扩增子通用引物ITS1(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)扩增建立标本DNA文库,于Miseq平台对文库进行测序,下机后数据完成质控、操作分类单元聚类(operational taxonomic units,OTU)及物种注释等生物信息分析,依据OTU占比判断优势菌种,对注释为新型隐球菌的OTU进行ITS分型。将ITS扩增子测序诊断结果与脑脊液墨汁染色、真菌培养结果进行比较,并提取血平板培养出的真菌菌落基因组DNA,靶向扩增其核糖体rDNA的转录间隔区ITS1区域和真菌特异性管家基因CAP59的部分片段经PCR扩增,于ABI PRISM 3730XL基因分析仪中进行Sanger测序进一步验证诊断结果。结果:1.第1-11号脑脊液样品经ITS扩增子测序得到30000-340000条优化序列(clean reads),其中属于新型隐球菌的OTU序列数占每份样品总OTU序列数的95.9%-99.97%,被认定为脑脊液样品中微生物群体的优势菌种,结合患者的临床表现,考虑诊断结果为1-11号患者患有隐球菌性脑膜炎,并且病原体新型隐球菌的ITS分型均为ITS 1型隐球菌,与之前关于中国新型隐球菌物种分布的研究一致。2.第12-15号脑脊液样品ITS扩增子测序得到8-60条优化序列,数量偏少,未检出可靠病原体。3.所有15例脑脊液ITS扩增子测序诊断结果与脑脊液墨汁染色、脑脊液真菌培养的诊断结果一致,也通过针对脑脊液血平板培养检出的菌落核糖体rDNA ITS-1区域、真菌特异性管家基因CAP59的部分片段的Sanger测序证实,且二者的分型结果一致。结论:脑脊液ITS扩增子测序技术可以作为中枢神经系统隐球菌病原学诊断的补充方法,可以相对无偏移、快速、灵敏地检出脑脊液中的病原体新型隐球菌,同时,它也是一项不依赖病原体培养的隐球菌基因分型技术,有利于隐球菌性脑膜炎的诊断与治疗。