论文部分内容阅读
马立克氏病毒（Marek’s disease virus,MDV）属疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科,它是鸡的一种高度传染性肿瘤疾病——马立克氏病（MD）的病原,该病以外周神经以及性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单核性细胞浸润和肿瘤形成为特征。MDV致病机理非常复杂,病毒感染与肿瘤产生相互影响。MD是兽医学、基础科学及比较医学研究的良好材料。MDV致瘤机理是MDV的研究中最令人感兴趣的,且MD是动物癌症中第一个能用疫苗来预防的疾病,它已成为人类癌症的一个理想的研究模型。此外,MDV是严格的细胞结合毒,唯一可以获得感染性的、脱离细胞的带囊膜病毒的组织是羽毛囊上皮细胞（Feather follicle epithelium, FFE）,游离的有囊膜的病毒在FFE形成后,通过皮肤或羽屑释放到环境中,成为感染其他鸡的传染源。但病毒在皮肤羽囊上皮细胞中如何组装成完全病毒,病毒蛋白与宿主蛋白如何相互作用,目前仍知之甚少。本研究对感染MDV鸡皮肤和羽髓进行了蛋白组学分析,通过质谱鉴定了病毒感染后表达差异显著的蛋白和新出现的蛋白,并对这些蛋白进行了生物信息学分析。本文首次从蛋白水平上报导了鸡皮肤和羽髓对MDV感染的宿主应答,可望在分子水平为研究MDV游离病毒形成和病毒致病机理提供新的资料。1.雏鸡感染马立克氏病毒的临床观察与病理鉴定56只一日龄SPF雏鸡腹腔注射感染马立克氏病毒（MDV）超强毒株RB1B（RB1B-CEF 0.2mL,1000PFU）,对照组40只鸡注射同等体积DMEM培养基。从感染后7天起（7dpi）,每隔一周每组取4只鸡扑杀,采血分离血清、采集羽毛、皮肤及内脏等,冻存于-70℃。试验结果发现SPF鸡感染两周后开始出现可见临床症状如消瘦、毛色苍乱等,用PCR可以从羽毛扩增出病毒基因pp38；3周后有劈叉、瘫痪等现象,剖检可见脾、肾等内脏肿大,法氏囊萎缩；4-5周后症状更加明显,并陆续有鸡死亡,剖检可见多数鸡内脏产生肿瘤,病理切片显示皮肤及羽毛有淋巴细胞浸润,琼脂扩散实验证实感染鸡血清中产生了MDV抗体,羽毛中含MDV抗原。这些结果说明SPF鸡已成功感染MDV,并发展成马立克氏病（MD）,为进一步开展羽囊和皮肤蛋白质组学研究提供了条件。2.鸡羽髓蛋白二维电泳方法的建立禽类的羽髓是多种病毒复制、包装以及释放的部位。其取样十分方便,是研究病毒复制、基因表达及宿主应答等的良好样本。本研究从SPF鸡羽根挤出羽髓,并提取其蛋白进行二维电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE），对不同裂解液、IPG胶条pH值范围、一向等电聚焦（IEF）条件、二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶浓度、蛋白上样量、染色方法等进行优化。结果表明以400μg羽髓蛋白样品,用17cm, pH 5-8 IPG胶条进行2-DE,第一向IEF聚焦条件为8000V,60000伏特小时,第二向SDS-PAGE凝胶浓度为11%,胶体考染法染色时可获得图谱最佳。2-DE图谱经PDQuest8.0.1分析,可检测到700个以上蛋白点,不同鸡只来源样本间的匹配率大于92%。本研究建立了鸡羽髓蛋白重复性较好、分辨率较高的二维电泳方法,该方法的建立为利用蛋白质组学方法研究禽类病毒的致病机理及病毒与宿主的相互作用等提供了技术基础。3.马立克氏病毒感染鸡的羽髓差异蛋白质组学研究羽毛是细胞游离马立克病毒释放的部位,是感染其他鸡的传染源,同时也是检测马立克氏病毒非常方便的材料,但感染马立克氏病毒鸡羽髓中宿主基因表达的变化及对病毒感染的应答仍不清楚。本研究用SPF鸡人工感染马立克氏病毒超强毒RB1B株,感染后21天采集鸡羽毛,按第二章所述方法提取羽髓蛋白,以17cm,pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡羽髓蛋白为对照,使用PDQuest软件对二维电泳图谱分析,寻找表达差异蛋白。结果攻毒组和对照组之间表达差异大于两倍的蛋白点有41个,其中攻毒组表达上调的蛋白点25个,下调的蛋白点7个,新出现的蛋白点有9个。选取差异较大的25个斑点进行质谱鉴定,共成功鉴定了21个斑点,对应于20个蛋白。分别是：载脂蛋白AI（apolipoproteinAI）、免疫球蛋白λ链（Immunoglobulin lambda chain）、肌动蛋白胞浆5型（Actin, cytoplasmic type 5）、调宁蛋白-1（Calponin-1）、14-3-3 sigma（两个斑点均为该蛋白）、ATP合酶α亚基（ATP synthase alpha subunit）、S100钙结合蛋白A11（S100calcium binding protein A 11）、卵转铁蛋白前体（Ovotransferrin precursor）、磷酸丙糖异构酶1（triosephosphate isomerase 1, TPI1）、D样异质性胞核核糖核蛋白（RCJMB04291737 kDa protein）、癌蛋白18（STMN1 13 kDa protein）、蛋白酶体激活因子（PSMC6 46 kDa protein）、真核生物翻译起始因子5A （Eukaryotic translation initiation factor 5A-1）、电子传递黄素蛋白α链（ETFA 34 kDa protein）、硫氧还蛋白（TXN Thioredoxin）、丙酮酸激酶M2 （PKM2 58 kDa protein）、超氧化物歧化酶2（Superoxidedismutase, SOD2）、蛋白质酪氨酸磷酸酶（ACP1 Low molecular weight phosphotyrosine protein phosphatase）等。功能分析表明这些蛋白涉及到物质代谢、细胞骨架成分、细胞增殖相关及免疫相关等,差异最明显的蛋白是代谢相关蛋白（40%）和细胞增殖相关蛋白（25%）4.马立克氏病毒感染鸡皮肤蛋白质组学研究1日龄SPF雏鸡人工接种马立克氏病毒超强毒RB1B株,感染后28天取皮肤,二维电泳裂解液提取蛋白,以17cm, pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡皮肤蛋白为对照,电泳图谱用PDQuest软件进行比对。结果共发现表达差异大于两倍的斑点23个,其中上调13个,下调3个,新出现7个。选取分辨清晰、差异显著的斑点20个进行质谱分析,共成功鉴定出16个斑点,对应于14个蛋白。其中三个上调斑点均鉴定为载脂蛋白AI（Apolipoprotein AI, Apo AI）,经蛋白翻译后修饰软件预测,Apo AI有潜在的磷酸化和糖基化位点,因此三个斑点应为Apo AI的不同修饰状态。此外,β2微球蛋白（β2-microglobulin, BMG）、磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase, PGK1）等13个为新增或上调表达蛋白；转甲状腺素蛋白（TTR 15Kd protein）为下调表达蛋白。经功能分析,这些蛋白分别属于免疫相关蛋白,调节蛋白,细胞骨架蛋白,代谢相关蛋白及转运蛋白等。为验证蛋白质组学中发现的不同蛋白表达差异,本研究在mRNA水平对部分差异蛋白进行了分析。以β-actin为内参,通过半定量RT-PCR测定了差异表达蛋白Apo AI及β2微球蛋白的mRNA水平,并通过Western blot测定了Apo AI的蛋白水平。结果证明攻毒组与对照组之间Apo AI及β2微球蛋白的mRNA水平、Apo AI蛋白水平均有显著性差异,该结果与2-DE一致,进一步证明,本研究的蛋白组学结果正确。本研究结果也提示马立克病毒感染后使皮肤产生炎症并有淋巴细胞浸润,可能正是因为这些蛋白的改变,使得细胞的代谢紊乱,细胞周期异常,导致皮肤病变及肿瘤细胞大量繁殖。本研究结果为进一步了解病毒的致病机理、传播、诊断及预防提供了基础资料。