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背景:青光眼滤过手术（glaucoma filtration surgery,GFS）是治疗青光眼的常规手术方式。而手术成功的关键是在结膜下形成一个长久有效的功能性滤过泡。但滤过泡瘢痕形成会阻碍房水的外流和吸收,引起手术失败。滤过泡瘢痕形成是手术区域结膜以及结膜下组织纤维化反应的结果,以肌成纤维细胞激活、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）大量沉积为特点。转化生长因子（transforming growth factorβ,TGF-β）是参与肌成纤维细胞激活的关键因子,可以促进靶细胞的增殖、迁移、肌成纤维细胞转化以及相应ECM的合成。激活后的肌成纤维细胞特征性表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,具有更强的收缩和分泌功能,促进伤口闭合和ECM沉积。同时肌成纤维细胞具有去分化的潜能,在一定条件下可被诱导失去特征性表型,恢复为非活性的前体细胞,从而逆转纤维化。因此抑制肌成纤维细胞激活和促进肌成纤维细胞去分化是抗纤维化治疗的两种思路,分别从抑制纤维化发生和逆转纤维化两个方向来减轻纤维化进展。环氧化酶（cyclooxygenase,COX）2是炎症和增殖相关疾病中前列腺素合成的关键酶,可参与多种纤维化疾病的调控。非甾体类抗炎药可通过抑制COX-2的功能而影响纤维化疾病的发展。溴芬酸钠（bromfenac sodium,BS）作为目前眼科常用的非甾体类抗炎药,具有高效抑制COX-2且角膜毒性小的优点,但关于该药物在GFS术后滤过泡瘢痕形成中的作用尚未见报道。目的:利用TGF-β1诱导人结膜成纤维细胞（human conjunctival fibroblast,Hcon F）构建纤维化细胞模型,从抑制纤维化发生和逆转纤维化两个方面探讨BS的抗纤维化作用及其机制。之后通过小鼠GFS模型进一步研究BS对GFS术后滤过泡瘢痕形成的作用。方法:1.以Hcon F为研究对象,利用TGF-β1体外诱导构建纤维化细胞模型。通过CCK-8检测细胞增殖。细胞免疫荧光检测α-SMA和F-actin的表达。Western Blot检测α-SMA、Collagen-1、Fibronectin、COX-2、p-Smad2/3、Smad2/3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT和AKT的表达。2.给予BS预处理,探讨BS对TGF-β1诱导的Hcon F纤维化的作用及机制。通过CCK-8检测细胞增殖。细胞免疫荧光检测COX-2的表达。Western Blot检测α-SMA、Collagen-1、Fibronectin、COX-2、p-Smad2/3、Smad2/3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT和AKT的表达。利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）和慢病毒感染技术分别干预Hcon F中COX-2基因的表达,探讨COX-2对纤维化的影响,明确BS预处理抑制纤维化发生的作用机制。通过CCK-8检测细胞增殖。Western Blot检测Bax、Bcl2、cleave-PARP、α-SMA、Collagen-1、Fibronectin、COX-2、p-AKT和AKT的表达。3.利用TGF-β1诱导Hcon F 48h构建纤维化细胞模型,然后撤去TGF-β1,一组加BS继续培养72h,另一组不加BS继续培养72h。利用免疫荧光、q PCR、Western Blot检测α-SMA、Collagen-1、Fibronectin的表达。明确BS诱导肌成纤维细胞去分化和逆转纤维化的作用。4.以C57BL/6J小鼠为研究对象,构建GFS手术模型,监测术前、术后3天眼压（intraocular pressure,IOP）变化,观察记录术后3天滤过泡的形态。之后实验分为正常组、GFS组、MMC组、BS结膜下注射组和BS点眼组,分别于术后3、7、14、21、28天观察滤过泡的形态并拍照。术后28天处死小鼠取眼球分别进行石蜡切片行HE和Masson染色检测滤过泡结构和局部胶原沉积;进行冰冻组织切片行免疫荧光染色检测滤过泡组织内α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin表达情况。结果:1、5ng/ml TGF-β1于24、48、72h均可促进Hcon F的增殖。TGF-β1可促进Hcon F中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin的表达,于48h作用最明显。TGF-β1作用48h促使Hcon F形态改变,由细长梭形转变为体积增大的星形或三角形,伴有细胞骨架增粗和α-SMA阳性表达。TGF-β1可促进Hcon F中COX-2、pSmad2/3、p-ERK1/2、p-AKT的表达,早期随着TGF-β1作用时间的延长蛋白表达逐渐增加,晚期逐渐降低。2、应用CCK-8检测细胞增殖显示100μg/ml为BS安全有效的作用浓度。使用100μg/ml BS预处理Hcon F,可以抑制TGF-β1诱导的Hcon F的增殖以及α-SMA、Fibronectin、COX-2、p-AKT的表达。为进一步研究BS抑制纤维化的机制,我们利用si RNA和慢病毒感染技术干预Hcon F中COX-2基因的表达,发现COX-2基因沉默抑制TGF-β1诱导的Hcon F的增殖,下调TGF-β1诱导的Hcon F中α-SMA、Collagen-1、Fibronectin、COX-2、p-AKT的表达,促进肌成纤维细胞中凋亡相关蛋白Bax/Bcl2、cleave-PARP的表达。COX-2过表达促进Hcon F增殖,上调细胞中α-SMA、Collagen-1、Fibronectin、COX-2、p-AKT的表达,而PI3K抑制剂LY294002逆转了COX-2过表达引起的α-SMA,Collagen-1和Fibronectin的升高。3、5ng/ml TGF-β1作用48h诱导Hcon F由细长梭形变为宽大的星形或三角形。在去除TGF-β1后,上述细胞形态仍可持续72h,伴有α-SMA、Collagen-1、Fibronectin持续高表达。在去除TGF-β1,加入100μg/ml BS继续培养72h后发现BS诱导肌成纤维细胞去分化,表现为细胞形态恢复为类似于原始成纤维细胞的细长梭形,同时α-SMA、Collagen-1、Fibronectin表达降低,且该作用不依赖于BS对COX-2的抑制作用。4、小鼠GFS模型构建成功。术后3天于手术部位可见微白、隆起的滤过泡结构。IOP比值统计结果显示术后3天小鼠IOP较术前明显降低。5、依据Kronfeld滤过泡分型方法对各组小鼠术后不同时间点的滤过泡形态进行评估,发现术后3天,各组均可见到隆起的滤过泡。GFS组滤过泡于术后14天开始相继扁平、消失,并伴有新生血管的生长。MMC组、BS结膜下注射组和BS点眼组于术后21天才开始出现滤过泡变形、消失。根据滤过泡存活情况绘制生存曲线发现4组间滤过泡的存活具有明显差异（P=0.0056）。与GFS组相比,MMC组（P=0.0033）、BS结膜下注射组（P=0.0168）、BS点眼组（P=0.0259）术后28天滤过泡生存率均高于GFS组。但MMC组与BS结膜下注射组、BS点眼组组间比较无显著差异。6、GFS术后28天滤过泡HE和Masson染色发现,正常结膜下组织结构疏松。GFS组滤过泡组织近巩膜处可见排列致密的纤维组织增生,成纤维细胞增多,胶原沉积增加。MMC组和BS点眼组均可见结膜下组织结构疏松,胶原纤维增生较少。BS结膜下注射组滤过泡组织较薄,虽然组织排列紧密,但是巩膜上胶原纤维增生减少,结膜与巩膜之间可见明显腔隙结构。7、GFS术后28天滤过泡组织免疫荧光结果显示,正常小鼠结膜下组织中可见少量α-SMA、Collagen-1和Fibronectin的表达。GFS组滤过泡组织中α-SMA、Collagen-1和Fibronectin表达明显增加。而在MMC和BS处理之后滤过泡组织中α-SMA、Collagen-1和Fibronectin表达均下降。结论:1.成功构建TGF-β1诱导的Hcon F纤维化模型。TGF-β1时间依赖性地促进COX-2、p-Smad2/3、p-ERK1/2、p-AKT等蛋白的表达。2.BS预处理可以抑制TGF-β1诱导的Hcon F增殖、转化和Fibronectin的合成,从而抑制纤维化的发生。BS的抑制作用可能是通过抑制TGF-β1/COX-2/AKT信号通路实现的。3.TGF-β1诱导的肌成纤维细胞状态可持续存在,至少持续72h。BS在不依赖于抑制COX-2的作用下诱导肌成纤维细胞去分化,表现为细胞形态恢复,肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA下调和ECM合成能力降低。BS可以逆转TGF-β1诱导的Hcon F纤维化。4.BS两种给药方式（BS结膜下注射和BS滴眼液点眼）可以减少滤过泡组织内肌成纤维细胞的积聚和ECM的沉积,从而抑制GFS术后滤过泡瘢痕形成,延长滤过泡的存活。