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天然橡胶(Hevea brasiliensis Musll-Arg.)是一种重要的工业原料和不可缺少的战略物资。橡胶种植业是我国热带地区重要的支柱产业和优势产业。橡胶树炭疽病是当前橡胶生产上影响胶乳产量和品质的重要病害,胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)为主要的致病菌之一。目前,生产上对该病的防治主要依靠施用化学农药,而化学防治往往导致杀伤天敌,长期广泛使用化学农药,增加生产成本、病原菌易产生抗药性、且污染环境、对人畜健康造成威胁。国内外现有对橡胶树胶孢炭疽菌致病机理,抗药性机理和互作机制研究报道极少,进一步阐明该病灾变规律,特别是致病分子机理,选育抗性品种和创新防治策略,是产业发展中亟待解决的植保问题。本研究在广泛收集国内橡胶主产区炭疽病菌基础上,利用根癌农杆菌介导转化T-DNA插入法(ATMT法)构建HBCg01菌株T-DNA随机插入突变体库；建立橡胶树种质对胶孢炭疽病抗病性评价和HBCg01菌株突变体筛选方法,明确国内橡胶树主栽品系抗病性水平及突变体筛选品系,筛选HBCg01菌株致病性缺陷突变体,对致病性缺陷突变菌进行表型观察和分子分析。同时,与北京华大基因科技公司合作开展强致病力胶孢炭疽菌株(HBCg01)的全基因组序列测定；结合HBCg01菌株的全基因数据库,通过本地Blast程序定位T-DNA标记的基因序列,预测潜在的致病基因,并对致病性相关的CgATPase基因进行克隆与功能分析,为进一步确定和分离炭疽菌(HBCg01)致病基因提供研究材料,也有助于阐明橡胶树胶孢炭疽菌致病分子机理。采用ATMT突变技术成功构建了含4128个转化子的橡胶树胶孢炭疽菌(HBCg01) T-DNA随机插入突变体库,转化效率为150～400个转化子/106孢子；PCR检测阳性转化子占86.96%, Southern blot分析T-DNA为单位点整合的转化子占60.4%；转化子在不含氯嘧磺隆PDA平板上转接继代培养10次后仍保持氯嘧磺隆抗性且表型稳定,表明插入外源基因能够稳定遗传和表达。建立和采用室内离体橡胶叶接种法、田间抗病种质圃人工接种法和自然发病条件下的田间定期病害调查方法,明确46份橡胶主要种质的抗病性水平：高度抗病(HR)类型的0份；抗病(R)类型8份,占17.39%；中度感病(MS)类型19份,占41.3%；感病(S)类型16份,占34.78%；高度感病(HS)类型3份,占6.52%。选取中度感病品种——热研7-33-97为致病缺陷型突变体筛选寄主,以无伤口、古铜色叶期的热研7-33-97叶片为接种材料,筛选HBCg01菌株致病性缺陷突变体,初筛接种带菌琼脂块,获得的致病缺陷菌再用孢子悬浮液接种重复验证。从4128个胶孢炭疽菌T-DNA插入突变转化子中筛选到32个致病缺陷突变菌。利用热不对称交错PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)技术从15株致病性缺陷突变菌中获得了16条T-DNA插入位点的基因组侧翼序列。Southern blot结果表明,供试的15个致病缺陷突变菌中,14个为单拷贝插入,1个为双拷贝。致病缺陷突变菌T-DNA插入位点的侧翼序列分析表明：突变菌Mut-28和Mut-24中的T-DNA分别插入到HBCg01菌株编码有性态(Glomerella cingulata)硬质表面诱导蛋白基因Chip5和cAMP-dependent PKA信号传导途径的蛋白激酶调节亚基(PKAR)基因中(E≤3e-135)；突变菌Mut-29中的T-DNA插入编码calcium-translocating P-type ATPase酶基因(含P-type ATPase酶保守结构域)中(E=0)；突变菌Mut-4和Mut-15中的T-DNA分别插入假定基因分别编码Glycosyltransferase family 28 domain-containing protein和 Mov34/MPN/PAD-1 family protein (E≤ 1e-171);6个突变菌Mut-7、 Mut-9、 Mut-10-1、Mut-13、Mut-19和Mut-23中的T-DNA插入的假定基因在真菌中没有比对到同源性,很可能是胶孢炭疽病菌新的致病基因；其余的5个突变菌Mut-8、Mut10-2、Mut-18、Mut-26和Mut-30中的T-DNA插入的预测基因与希金斯炭疽菌(C. higginsianum)和禾生炭疽菌(C. graminicola)的假定或未知功能的基因编码蛋白基因序列存在一定的相似性(E≤1e-159)。与北京六合华大基因科技股份有限公司合作,采用高通量Illumina测序技术对HBCg01的全基因组进行paired-end测序,获得HBCg01菌株的全基因组序列总长度为55.495 Mb, GC含量为53.62%,15-mer期望深度为34。利用致病力显著降低突变菌Mut-29中的T-DNA插入位点的基因组侧翼序列,通过本地Blast程序与野生菌的全基因组数据库比对,将T-DNA标记基因定位于contig 311的核酸序列中,再利用网站The FGENESH Program (Softberry Inc., Mount Kisco, NY. U.S.A., http://linuxl.softberry.com/berry.phtmL),以Alternaria, botrytis, Fusarium graminearum和Magnaporthe oryzae等模式菌株进行基因克隆。T-DNA标签插入该预测基因起始密码子上游的617 bp处,编码1396个氨基酸,从起始密码子到终止密码子长4273 bp,含有2个外显子和1个内含子。该基因编码的氨基酸序列与其它真菌的P-type ATPases酶氨基酸序列有较高的同源性,该类基因具有calcium-translocating P-type ATPase的保守结构域,将该基因命名为CgATPase基因(GenBank:JX982793.1)。CgATPase基因功能分析表明,该基因调控HBCg01菌株的菌落生长速度、产孢量、菌落形态、孢子大小和维持细胞完整性。CgATPase基因缺失影响菌落生长速度和菌落形态,致使产孢量显著降低；CgATPase基因缺失突变体对橡胶树叶片致病性降低,而CgATPase基因互补菌株能恢复部分致病力,表明CgATPase基因与胶孢炭疽菌的致病力相关。CgATPase基因与胶孢炭疽病菌穿透洋葱表皮细胞有关,CgATPase基因缺失后仅有极少数的孢子萌发能穿过洋葱表皮,在其细胞内只观察到少量初生菌丝。△CgATPase菌株与野生型橡胶胶孢炭疽菌性状有差异,CgATPase恢复菌株的性状与野生型橡胶胶孢炭疽菌生物学表型相似之处包括：(1)△CgATPase菌株的细胞完整性降低：不同浓度SDS处理后,△CgATPase菌株在0.04%SDS浓度下生长严重受到抑制,而野生菌和CgATPase恢复菌株0.08%SDS依然可以生长；(2)刚果红和Calcoflour white抑制△CgATPas突变菌、CgATPase恢复菌和野生橡胶胶孢炭疽菌的生长,△CgATPas突变菌生长受抑制程度高于基因恢复菌和野生橡胶胶孢炭疽菌；不同浓度的NaCl处理后,CgATPase恢复菌株、△CgATPas突变体和野生型对盐胁迫的敏感性变化不大；Sorbitol高渗透剂对野生型、CgATPase恢复菌株和△CgATPas突变体菌落生长速度没有影响,且Sorbitol对CgATPase恢复菌株、突变体和野生型抑制作用差异不明显；CgATPase不参与有毒物质多菌灵和Chlorimuron的诱导响应。