天然免疫是机体抵御外来入侵病原体的第一道防线。天然免疫细胞如巨噬细胞和DC可表达模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别外来入侵的病原体,激活炎症相关信号通路,如NF-κB,MAPK和IRF3信号通路,导致促炎性细胞因子如IL-6,TNF-α以及Ⅰ型干扰素IFN-β的产生,启动天然免疫反应并增强获得性免疫应答。过度激活的天然免疫反应打破机体的免疫平衡,严重者有可能会导致自身免疫系统紊乱,发生自身免疫性疫病,更有甚者会发生肿瘤。因此,天然免疫应答的精准调控对于维持机体的平衡和预防炎症性自身免疫疾病的发生是非常必要的。本课题旨在研究天然免疫的表观调控机制,主要是研究了染色质结构维持蛋白4(Structural maintenance of chromosome 4,Smc4)对TLRs和病毒触发的天然免疫反应的调控作用和相关机制。第一部分 Smc4促进TLRs或病毒感染触发的促炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素产生在天然免疫应答过程中,巨噬细胞主要负责抵御外来入侵病原体。外源病原体感染巨噬细胞,激活多种级联放大信号通路诱导大量转录因子及炎性细胞因子和干扰素的产生。表观修饰在炎症应答过程中发挥重要的调控作用。为了探究表观修饰分子在天然免疫应答中的调控作用,我们以THP-1为细胞模型,通过表观遗传筛选文库筛选出调控LPS触发THP-1细胞产生IL-6的候选分子。发现干扰Smc家族成员表达,LPS触发的IL-6的产生显著下调,提示Smc可能在天然免疫反应中发挥作用。接着我们针对筛选到的Smc2、Smc3、Smc4和Smc5分别设计了三个特异性靶向干扰RNA,分别干扰其在小鼠原代腹腔巨噬细胞的表达,通过ELISA法检测LPS触发的IL-6的产生,发现干扰Smc2和Smc4能够显著抑制LPS诱导的IL-6的产生。接着,我们对Condensin核心亚基Smc2和Smc4在小鼠器官和细胞中的mRNA水平进行了检测,定量PCR检测发现,Smc2和Smc4在小鼠免疫器官和免疫细胞中表达较高,而且Smc4在巨噬细胞中呈选择性高表达。利用Western blot方法对TLR或病毒诱导Smc4的蛋白表达水平进行检测,发现,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中,LPS刺激或者HSV,SeV感染细胞后,Smc4的蛋白水平明显上调,提示Smc4可能在天然免疫应答过程中发挥作用。进一步,我们在小鼠原代腹腔巨噬细胞中干扰Smc4,分别用不同的TLRs配体刺激和病毒感染细胞,运用定量PCR和Western blot实验发现沉默Smc4后,IL-6,TNF-α和IFN-β的mRNA和蛋白水平显著低于对照组。我们运用流式细胞术检测了 Smc4对巨噬细胞表型和凋亡的影响,发现在TLR配体刺激或病毒感染情况下,沉默Smc4并不能影响巨噬细胞的表型和凋亡情况。我们运用CRISPR/Cas9技术构建了靶向Smc4的gRNA,在RAW264.7细胞中敲除Smc4的表达(Smc4+/+和Smc4-/-细胞)。我们发现当Smc4缺失(Smc4-/-)后,TLRs或病毒触发的IL-6,TNF-α和IFN-β的mRNA和蛋白水平显著低于对照组细胞(Smc4+/+)。为更进一步证实我们的结论,我们构建了 Smc4过表达质粒,运用JetPEI将Smc4质粒转染RAW264.7细胞,发现过表达Smc4可以显著促进TLRs或病毒触发的IL-6,TNF-α和IFN-β的mRNA和蛋白水平。接下来,我们进一步在小鼠体内研究了 Smc4的效应。我们构建了慢病毒包装si-Non和si-Smc4的LPS小鼠感染模型,发现体内沉默Smc4的小鼠肺脏炎性细胞浸润减弱,血清中产生的IL-6,TNF-α和IFN-β水平以及小鼠死亡率均明显降低。而且在LM感染情况下,沉默Smc4后小鼠血清中IL-6,TNF-α和IFN-β的产生也显著降低。综上所述,本部分研究结果提示在巨噬细胞中,Smc4能够促进TLRs或病毒触发的IL-6,TNF-α和IFN-β的产生。第二部分 Smc4通过增强NEMO转录而促进NF-κB和IRF3信号通路的活化在天然免疫应答过程中,NF-κB作为早期转录因子,在TLRs刺激或病毒感染情况下,能够迅速活化从而激活靶基因的表达。在静息状态,MAPK定位在细胞浆,当受到外界刺激后,MAPK信号通路通过三种激酶级联传导的方式,转运到细胞核,促进多个转录因子如myc,jun和fos的转录活化,从而调节细胞的生长、分化以及炎症的发生。IRF3作为天然免疫应答中发挥重要作用的转录因子,在病毒感染细胞后发生核转位进入细胞核,结合到IFN-β的启动子上从而激活IFN-β的转录。那么,在Smc4介导的TLRs或病毒触发的IL-6,TNF-α和IFN-β的产生过程中,这些信号通路是否在其中发挥作用?为了更进一步研究Smc4介导IL-6,TNF-α和IFN-β产生的调控机制,我们对可能参与调控的信号通路进行筛选。Western blot检测发现,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中干扰Smc4后,LPS触发的P65和IRF3的磷酸化水平显著降低,其上游信号分子IKKα/β和TBK1的磷酸化水平,以及NEMO的表达水平显著降低,但TRAF3却没有变化;MAPK信号通路的ERK,JNK和P38的磷酸化水平也没有显著变化。同样,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中干扰Smc4以后,用病毒SeV感染细胞,发现沉默Smc4显著抑制了 P65,IKKα/β,IRF3,TBK1的磷酸化和NEMO的表达水平。为了更进一步研究体内Smc4在天然免疫应答中的调控作用,我们取LPS感染的lenti-siNon和lenti-siSmc4小鼠肺脏组织进行Western blot检测发现,体内沉默Smc4后,小鼠肺脏组织中NEMO的表达,P65和IRF3的磷酸化水平都显著低于对照组。进一步过表达实验也证实了这一结果。为了探究Smc4是否通过调控NEMO而激活NF-κB和IRF3靶基因的表达,我们通过干扰NEMO再过表达Smc4进行ELISA检测,发现Smc4通过NEMO而促进TLRs和病毒触发的IL-6,TNF-α和IFN-β的产生。那么,Smc4是如何调控NEMO的呢?转录水平还是蛋白水平?接下来,我们通过定量PCR和Western blot实验进行验证。首先,我们在小鼠原代腹腔巨噬细胞中干扰Smc4的表达,通过定量PCR检测在LPS刺激下NEMO的mRNA水平,发现,当沉默Smc4以后,NEMO的mRNA水平显著低于对照组;SeV感染干扰Smc4的细胞后,也得到一致的结果。进一步用敲除Smc4的RAW264.7细胞进行验证,我们发现在缺失Smc4后,LPS刺激和病毒感染后,NEMO的mRNA水平显著降低。而当用CHX处理,Smc4+/+和Smc4-/-细胞,发现,Smc4并不能改变NEMO的蛋白降解速率。因此,我们推测Smc4调控NEMO的转录水平。这部分结果表明Smc4通过增强NEMO的转录水平而促进NF-κB和IRF3信号通路的活化。第三部分Smc4通过招募H4K5ac结合nemo启动子而促进NEMO的转录转录水平的调控是调控蛋白表达的一个重要环节,Smc家族成员能够通过结合DNA而发挥转录调控作用。接下来,我们重点研究Smc4如何调控NEMO的转录。首先,我们构建了nemo启动子区含Gluc-SEAP的报告基因,报告基因实验发现Smc4能够显著促进NEMO的转录活化。接下来,我们对nemo启动子区上游2000 bp区域设计了多对引物,通过ChIP-QPCR实验对SeV感染的RAW264.7细胞研究发现,Smc4能够结合到nemo启动子区上游930-680 bp的区域内。我们运用转录结合位点预测软件JASPAR对nemo启动子区上游930-680 bp的区域进行分析预测,预测GCTTGCT核心序列可能是Smc4结合NEMO的位点,接下来针对这一序列设计了生物素标记的探针,EMSA实验发现,无论在SeV未感染或感染情况下,Smc4能够结合到neno启动子区的GCTTGCT序列。为了进一步确认这一结合的特异性,我们将GCTTGCT序列突变为GCATCCT,通过突变竞争EMSA实验发现,当突变这一核心序列后,Smc4不能和过量的突变探针相结合,而与少量的标记探针相结合,也就说明Smc4确实能够与nemo启动子区GCTTGCT序列相结合。组蛋白H3和H4乙酰化修饰在基因转录活化过程中有着非常重要的作用,接下来,我们用SeV感染Smc4+/+和 Smc4-V-细胞,通过ChIP实验检测,发现H3ac并不能在nemo启动子区募集,而H4ac却有显著的募集。当缺失Smc4后,H3ac在nemo启动子的募集情况并没有发生变化,而H4ac的募集却显著降低。由于H4K5ac和H4K16ac在基因转录活化过程中发挥重要作用,因此我们对其进行筛选检测发现,当Smc4缺失以后,nemo启动子区的H4K5ac募集显著低于:Smc4+/+细胞,而H4K16ac却没有明显变化。这部分研究结果证明,Smc4通过招募H4K5ac到nemo启动子区,从而促进NEMO的转录。