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利用多基因共表达策略将多种不同性状目的基因转入植物，以提高植物的综合抗逆能力是目前转基因技术应用重要领域之一。本研究构建通过携带NotⅠ/Bsp120Ⅰ同尾酶的植物转化载体和携带SpeⅠ/XbaⅠ/NheⅠ同尾酶克隆载体，利用同尾酶连接后原有酶切位点消失原理，可不断在植物转化载体中连入新的已知功能的Bt抗虫基因cry1Ac、cry3A和选择标记gus基因。同时通过在植物转化载体中增加MAR结构，载体中更换不同启动子、在启动子后加入增强子序列及调换连入外源基因ORF的顺序等方法，对多基因植物转化载体系统进行改进，构建出系列植物转化载体，采用农杆菌介导法转入烟草中进行表达验证，以期实现多外源基因稳定与高效表达。主要研究结果如下: 1.以pCAMBIA1302为基础表达载体构建了植物表达载体p1780，该载体含有来源于pCAMBIA1302的nptⅡ抗性选择标记（另引入独立的NOS终止子），克隆位点两侧分别添加了保证外源基因稳定转录表达的烟草MAR序列及同尾酶系统的酶切位点Bsp120Ⅰ和SpeⅠ;以pBI121为基础克隆载体构建了克隆载体p699(35S)，该载体含有35S启动子和位于35S启动子下游的拟南芥AtADH5-UTR翻译增强子序列;通过对p699替换启动子，改造成分别含有Coymv和FMV启动子的克隆载体p820(coy)和p820(FMV);三个克隆载体克隆位点均为NotⅠ和XbaⅠ/NheⅠ同尾酶酶切位点;所构建的植物表达载体p1780和克隆载体p699/p820，可利用同尾酶技术选用合适的双酶切(NotⅠ/Bsp120Ⅰ和SpeⅠ/XbaⅠ/NheⅠ)构建含有一个和（或）多个外源基因的植物表达载体系统，该系统可方便对同一表达载体引入不同外源目的基因及实现不同基因的排列组合。 2.利用上述载体系统，成功构建了8个具有已知功能目的cry1Ac基因和cry3A基因及gus报告基因不同组合的植物转化载体:p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac、p1780-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-Coy∷cry3A-FMV∷gus-35S∷cry1Ac、p1780-FMV∷gus-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A。 3.将不同植物转化载体摇菌形成侵染菌液，设置Kan抗生素和Cef抗生素各11个浓度梯度，确定转基因过程中分化培养基和生根培养基的Kan最适浓度分别为50mg/L和75mg/L，Cef最适浓度分别为300mg/L和600mg/L，在此浓度条件下可很好抑制农杆菌生长且形成良好烟草分化植株;将不同转化载体利用农杆菌介导法转化烟草，经分化、生根成苗、再分化、温室及荫棚训化、大田移栽等步骤，每个不同转化载体获得13～30株系不等，最终共获得155个株系612棵阳性烟草成苗。 4.经gus组织化学染色初步筛选，6个含有gus基因的转化载体所获烟草转基因植株均获得阳性染色结果;进一步用nptⅡ抗性标记基因、gus基因、cry1Ac和cry3A目的抗虫基因各自的特异性引物进行转化烟草植株的PCR扩增检测，所有具相应外源基因的转基因烟草株系均可获得阳性扩增结果，证明转化载体所含外源基因已与烟草基因组整合。 5.采用QRT-PCR对每个转化载体转化的阳性烟草中随机选取的10个株系进行gus、cry1Ac和cry3A基因转录检测，不同株系相应目的基因转录丰度介于103～107之间，表明转化载体所携带外源基因可在烟草体内成功转录，同一转化载体获得不同株系、不同外源基因排列组合的目的基因间转录丰度无显著性差异。 6.采用ELISA试剂盒对相应的转基因株系Cry1Ac和Cry3A蛋白进行检测，Cry1Ac蛋白表达量介于0.45～11.61μg/g之间，Cry3A蛋白表达量介于0.78～6.73μg/g之间，表明外源Bt基因可在转基因烟草植株体内表达相应蛋白。不同转化载体之间蛋白表达存在差异，同一转化载体不同株系之间也存在差异。 7.对转基因烟草植株进行室内饲虫试验，表明外源Bt毒蛋白具有较高杀虫活性，其中含有cry1Ac基因的4个转化载体转化的所有株系、含有cry3A基因的2个转化载体转化的所有株系分别对棉铃虫和茄二十八星瓢虫一龄幼虫在饲喂第1d致死率达到100％，其余含不同Bt基因的转基因株系对棉铃虫和茄二十八星瓢虫幼虫致死效果表现慢效性，一般在第6d或第7d达到100％;不同转化载体所携带Bt基因毒蛋白表达与相应虫试结果高度相关。 8.所构建植物转化载体具有较好应用前景，用于其他植物材料进行转化防治棉铃虫时推荐优先使用p1780-FMV∷gus-35S∷cry1A、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac、p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-FMV∷gus-35S∷cry1Ac-Coy∷cry3A;用于防治茄二十八星瓢虫时推荐使用p1780-Coy∷cry3A-35S∷cry1Ac-FMV∷gus、p1780-Coy∷cry3A-FMV∷gus-35S∷cry1Ac。